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实验八DNA的酶切与连接（二)2017-5-24

实验目的1.掌握DNA连接酶的一般性质和作用机制。2.掌握DNA连接体系的建立以及连接样品的检测。

实验原理——连接核酸片段可以通过连接酶的作用连接起来而获得重组分子。DNA连接酶催化双链DNA分子中相邻碱基的5’–P末端与3’-OH间形成3’,5’-磷酸二酯键。一个DNA片段的5’-P末端与另一个3’-OH末端相互靠近时,在DNA连接酶的作用下,有Mg2+,ATP存在的缓冲系统中可以被连接起来而形成重组子。

实验原理——连接

连接反应中值得注意的几个问题DNA连接酶常用的DNA连接酶有两种（二者作用机理类似)：来自大肠杆菌的DNA连接酶来自噬菌体的T4DNA连接酶（最常用)——T4连接酶的活性用Weiss单位表示，Weiss单位是指在37℃下20min内催化1mol32P从焦磷酸根置换到[γ,β-32P]ATP所需的酶量。

连接反应中值得注意的几个问题2.连接反应的温度DNA连接酶的最适反应温度为37℃。但在此温度下,粘性末端的氢键结合很不稳定,折中办法是12℃过夜。

连接反应中值得注意的几个问题3.DNA的平末端和粘性末端由于内切酶产生的DNA末端有平末端和粘性末端,因而连接反应中就有平末端连接和粘性末端连接。二者连接效率不同。粘性末端效率高,因而在底物浓度