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细胞WB实验详细流程

WesternBlot（WB）是检测细胞中特定蛋白表达水平的关键技术，广泛应用于生物医学研究。该技术通过电泳分离、转膜、抗体孵育等步骤实现目标蛋白的定性和半定量分析。

一、细胞WB实验准备

1.试剂与仪器准备

细胞WB实验的顺利开展依赖于试剂与仪器的充分准备。常用试剂包括RIPA裂解液（放射免疫沉淀分析裂解液），用于高效提取细胞总蛋白，其含有去垢剂如NP-40和脱氧胆酸钠，可破坏细胞膜结构并释放胞内蛋白；为防止提取过程中蛋白被内源性蛋白酶降解，需在裂解液中添加蛋白酶抑制剂混合物，通常以1:100比例加入；若研究磷酸化蛋白，还需额外添加磷酸酶抑制剂。蛋白浓度测定推荐使用BCA试剂盒（二辛可宁酸法），该方法相较于Lowry法更耐受还原剂干扰，灵敏度较高，检测范围一般为20至2000微克/毫升。SDS凝胶用于按分子量分离蛋白，可根据目标蛋白大小选择合适浓度的分离胶，例如6%～12%聚丙烯酰胺梯度。转膜缓冲液通常采用Tris-甘氨酸体系，含甲醇以促进PVDF或硝酸纤维素膜的活化与蛋白结合。关键仪器方面，电泳仪需具备稳定电压输出能力，常规分离蛋白时设定为80至120伏；转膜装置应确保均一电流分布，湿式转膜常设置为100毫安恒流、90分钟；化学发光成像系统用于检测HRP标记抗体产生的信号，要求具有高灵敏度和宽动态范围；高速低温离心机用于细胞裂解后澄清处理，推荐转速不低