ELISA常见原因,及技术讲座.doc

影响ELISA试验效果常见问题原因分析及解决办法 ELISA试验以灵敏度较高、特异性较好的特点在临床上得到了广泛的应用，但操作中的各个环节对试验的检测效果影响较大，如不注意，有可能导致显色不全、花板等结果。我将操作中各个环节常出现问题的原因及解决办法总结于下，以期给同行带来一些启发，提高试验质量。 操作步骤 可能原因 解决办法 ? 选择试剂 选择质量优良的检测试剂，严格按照试剂说明书进行操作，操作前将试剂在室温下平衡30-60分钟。 ??? ? ? 加?? 样 ? 1.血清或血浆标本分离不好即进行加样； 2.手工操作中，加样板过多造成加样后放入孵箱前等待时间过长(特别是室内温度较高时)； 3.加完标本再加酶试剂时酶溅出孔外。 ? 1.标本为血清：最好将血液先自然存放1-2小时后，再用3000rmp离心15分钟；标本为血浆：必须使用含抗凝剂的血液标本收集管，采血后必须立即颠倒采血管混合5-10次，放置一段时间后，3000rpm离心15分钟；若在几天内检测，可放在2-8℃冰箱中，若要贮存，则置于-20℃的低温冰箱内。 2.加样后及时放入孵箱。 3.加酶试剂后用吸水纸在酶标板表面轻拭吸干。 4.如果采用AT或其他全自动加样，最好选择FAME或其他后处理仪器加酶试剂。 5.标本较多时，请分批操作。 ? ? 孵?? 育 ? 1.孵育时未贴封片或加盖，使标本或稀释液蒸发，吸附于孔壁，难于清洗彻底； 2.孵育时间人为延长，导致非特异性结合紧附于反应孔周围，难以清洗彻底。 1.贴封片或加盖； 2.按说明步骤严格控制操作时间。 ? ? ? 洗?? 板 ? 1.采用手工洗板,孔与孔之间液体交叉。 2.采用半自动洗板机洗板时，洗液量不足，导致洗板不彻底；洗板针堵塞，抽吸不完全；洗板不畅，导致洗板效果差。 3.反应板过多造成洗板等待时间长。 1.保证洗液注满各孔，洗板针畅通，洗完板后最好在吸水纸（选择干净、无或少尘的吸水材料）上轻轻拍干； 2.合理安排，或多用几台洗板机。 ? ? 显?? 色 1. 显色剂配制后放置时间过长或使用过期显色剂； 2. 加显色剂时溅出孔外造成液体回流。 ? 1. 显色剂尽量在临用前配制，坚持不用过期显色剂，肉眼可见浅蓝色的TMB显色剂不用； 2. 加样时保持显色剂不外流； 3.A、B液应避免接触金属器械。 ? 终?? 止 加终止液时产生较多气泡，导致假阳性增加。 加终止液时应避免产生气泡。 读?? 板 读板时板底不清洁。 应保证酶标板清洁。 全过程 1.整个操作过程中保证酶标板不接触次氯酸; 2.实现ELISA检测标准自动化，有效提高检测质量。 ??? 在实际操作中，除了选择优良试剂外，必须严格按照操作步骤进行操作，同时作好室内质控、室间质评，以严谨的工作作风检测每一份标本，才能保证检测质量。现在国内已有相当数量的单位拥有全自动酶标仪，这对于实现ELISA标准化检测、提高检测质量起到了重要作用。 ELISA技术讲座一-抗原与抗体的反应 1.2 1.2.1　抗体的结构 抗体是能与抗原特异性结合的免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)。Ig分五类，即IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。与免疫测定有关的Ig主要为IgG和IgM。Ig由两个轻链（L）和两个重链（H）的单体组成。Ig的轻链是相同的，有κ（kappa）和λ（Lambda）两种型别。五类Ig的重链结构不同，这决定了它们的抗原性也不同。IgG和IgM的重链分别称为γ（gamma）链和μ（mu）链。IgG的结构见图。 ① 木瓜酶裂解部位?? ② 胃蛋白酶裂解部位 重链和轻链的N端的氨基酸排列顺序因各种抗体而异，称为可变区，分别用VH和VL表示。两者构成抗体的抗原结合部位，只与相应的抗原决定簇匹配，发生特异性结合（见图），是抗体专一性结合抗原的结构基础。 IgG可被木瓜蛋白酶分解为三个区段，其中两个相同的区段称抗原结合片段（Fab）。每个Fab都保存结合抗原的能力，但只有一个抗原结合位点，是单价的，与抗原结合后不出现凝集或沉淀。另一区段称Fc段，无抗体活性，但具有IgG特有的抗原性。 IgG可被胃蛋白酶分解为两个片段，一个Fab双体，称F（ab）2，能和两个相同的抗原结合；另一片段类似Fc，随后被分解成小分子多肽，无生物活性。 IgM是由五个单体组成的五聚体，含10个重链和10个轻链，具有10个抗原结合价，由于空间位置的影响，只表现为五个抗原结合价。IgM分子量约为900000，IgG分子量约为150000。 机体被微生物感染后，先产生IgM抗体，然后产生IgG抗体。经过一段时间，IgM抗体量逐渐减少而消失，而IgG抗体可长期存在，在疾病痊