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Neuritin论文：Neuritin对Neuralized介导的Notch信号途径配体JAG1泛素化的影响.doc
Neuritin论文：Neuritin对Neuralized介导的Notch信号途径配体JAG1泛素化的影响
【中文摘要】观察鉴定Neuritin对Neuralized蛋白表达水平以及对Neuralized介导的Notch信号途径配体JAG1蛋白表达水平、内吞及泛素化的影响,明确Neuritin与Neuralized介导的Notch信号通路的关系,探讨Neuritin在神经系统中的作用机制。方法：采用脂质体法将pIRES-HA-JAGl质粒,pcDNA3.1-flag-neuralized质粒,pcDN A3.1-his-neuritin质粒,pcDN A3.1-H A-ubiquitin质粒以及PBS/U6-neuritin siRNA质粒,分组转染至HEK293细胞。运用Western-Blot技术检测Neuritin过表达对Neuralized介导的Notch信号途径配体JAG1蛋白表达水平以及Neuralized蛋白表达水平的影响；之后运用直接免疫荧光技术观察Neuritin过表达对Neuralized介导的Notch配体蛋白JAG1内吞的影响；为进一步验证Neuritin对Neuralized介导的Notch信号途径配体JAG1蛋白的影响,本实验采用siRNA技术检测Neuritin表达降低对Neuralized介导的Notch信号途径配体JAG1蛋白表达水平以及观察Neuritin表达降低对Neuralized介导的Notch配体蛋白JAG1内吞的影响。最后,运用Ubiquitination assay技术检测Neuritin对Notch配体JAG1蛋白泛素化的影响。结果：1.通过PCR技术以及基因测序技术鉴定实验所需质粒的完整性和正确性；2.通过Western-Blot分析Neuritin对Neuralized及其介导的Notch途径配体JAG1表达水平的影响：(1) Neuritin过表达能够使得JAG1蛋白的表达增高,能够降低Neuralized蛋白的表达水平；(2) Neuritin表达降低能够使得JAG1蛋白的表达下调,能够增加Neuralized蛋白的表达水平；3.通过直接免疫荧光技术观察JAG1的细胞定位来评价Neuritin对Neuralized介导的Notch途径配体JAG1内吞的影响：(1) Neuritin过表达能够部分抑制Notch信号途径配体JAG1蛋白内吞；(2) Neuritin表达降低能够促进Notch信号途径配体JAG1蛋白的内吞；4.Ubiquitination assay技术观察对Notch信号途径配体JAG1泛素化的影响；Neuritin能够抑制Neuralized蛋白介导的JAG1蛋白的泛素化。结论：1.Neuritin能够能够逆转JAG1蛋白的表达下调,降低Neuralized蛋白的表达；2.Neuritin能够部分抑制Notch信号途径配体JAG1蛋白内吞；3.Neuritin蛋白能够抑制JAG1蛋白的泛素化。
【英文摘要】Object:To identify effects of Neuritin on Notch pathway mediated by Neuralized and mechanisms of Neuritin in the nervous system diseases, the protein expression levels of Neuralized was clarified and effects of Neuritin on ligand JAG1 protein expression, endocytosis, and ubiquitination were examine in Notch signaling pathway.Methods:Kidney 293 Cells were transiently transfected with the pIRES-HA-JAG1 plasmid, pcDNA3.1-flag-neuralized plasmid, pcDNA3.1-his-neuritin plasmid and PBS/U6-neuritin siRNA plasmid vector using Lipofectamine 2000. Overexpression of Neuritin, Expression level of JAG 1 and Neuralized was examined using immunoblotting; The encytosis of JAGI effected was observ-ed by Fluorescence microscope; Knock down Neuri
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