降解天然秸秆功能菌发酵产纤维素酶的研究.doc

【标题】降解天然秸秆功能菌发酵产纤维素酶的研究 【作者】梁彩凤 【关键词】康宁木霉??液体发酵??秸秆 【指导老师】王新惠 【专业】生物科学 【正文】1引言1.1?纤维素酶特性1.1.1?分子结构纤维素酶是降解纤维素生成葡萄糖的一组酶的总称，是起协同作用的多组分酶系[1]，能够水解纤维素的β-D-糖苷键生成葡萄糖。纤维素酶属于糖苷水解酶类，由内切葡聚糖酶( EG或CX)、外切葡聚糖纤维二糖水解酶(CBH,EC或C1)和纤维二糖酶(CB,β-葡萄糖苷酶)[2]组成，在它们的协同作用下才能将纤维素水解成葡萄糖[3,4]。微生物特别是真菌能产生这类酶的复合物，从而把纤维素分子降解为葡萄糖分子为自己所利用[5]。1906?年，Silliere?首次从蜗牛消化液中发现了纤维素酶[6]。1986?年ilbeurgh[7]曾对里氏木霉(T.reesei)的纤维二糖水解酶进行有限酶切，结果得到两个具有独立活性的结构域：一个具有催化功能的结构域(Catalytic domain，CD)，另一个是具有结合纤维素功能的结构域(Cellulose binding domain，CBD)，两者之间由一段高度糖基化的linker相连。整个分子呈楔形，球状核区表示包含催化位点和底物结合位点的CD区。大多数纤维素酶都是这样，只有少数微生物和高等植物产生的纤维素酶不具有这类结构域，如T.reesei的CBHI就没有CBD结构域。通常认为CBD对高效降解纤维素起到关键的作用，但T.reesei的CBHI在没有CBD的情况下仍具有水解纤维素的活性，在T.reesei的EG1的酶解过程中也观察到同样的现象。此外，Humicolainsolens的EG5和Cellulomonnas fimi的CenEG都并未发现具有CBD结构，但仍然具有水解酶活性。这些实验证明，在有些外切和内切酶中CBD对酶的催化活力是非必需的[5]。此外，纤维素酶还是胞外酶和诱导酶。因此，在提取纤维素时，不须破碎细胞，可直接离心，从上清液中获取。在发酵过程中纤维素酶的大量合成必须有诱导物的作用。纤维素、纤维低聚培养及其它结构类似物均可作为纤维素酶的诱导物，因此，用于纤维素酶发酵制备的培养基，必须加入这些物质[8]。1.1.2?催化机制纤维素酶在提高纤维素、半纤维素分解的同时，可促进植物细胞壁的溶解，使更多的植物细胞内溶物溶解出来并能将不易消化的大分子多糖、蛋白质和脂类降解成小分子物质，有利于动物胃肠道的消化吸收[9]。目前，纤维素酶分解纤维素的分子机制大致有以下几种假说[10]：改进的C1-Cx假说、顺序作用假说和竞争吸收模型。这些学说都认为，纤维素酶降解纤维素时，先吸附到纤维素表面，然后其中的EG?(内切酶)在葡聚糖链的随机位点水解底物产生寡聚糖，CBH(外切酶)从葡聚糖链的非还原端进行水解产生纤维二糖，CB水解纤维素二糖为葡萄糖，在整个降解过程中，纤维素降解菌中的这3类酶“协同作用”最终完成对纤维素的降解。内切葡聚糖酶首先作用于微纤维素的无定型区，随机水解β-1,4糖苷键，产生大量带非还原性末端的小分子纤维素；外切葡聚糖酶从这些非还原性末端上依次水解β-1,4糖苷键，生成纤维二糖及其它低分子纤维糊精；β-葡萄糖苷酶将纤维二糖和寡糖水解成葡萄糖分子。这种协同作用普遍存在，且还可以发生在内切酶之间、外切酶之间、甚至发生在不同菌源的内切酶与外切酶之间。一般地说，协同作用与酶解底物的结晶度呈正比[11]。纤维素酶催化效率比一般酶高106～107倍，酶的催化反应具高度专一性，酶催化活力可被调节控制，无毒性[12]。2000?年，Ute Heinze?等用酶法和化学法对带有22320羧甲基的纤维素降解特性进行了研究，发现纤维素的降解具有功能区域选择性。2003?年，Shawn?.Mansfield等研究粪肥杆菌中单一组分的纤维素酶在纤维素降解中的作用时发现，单个纤维素酶的作用是独立的，而不同酶分子之间的作用是相互补偿的[13]。1.2?康宁木霉特性纤维素酶的产生菌主要有木霉、青霉和曲霉等，其中康宁木霉(Trichoderma koningi)被认为是最好的纤维素酶产生菌之一，其产生的纤维素酶系比例适当，可以有效地酶解纤维素类物质[14]。康宁木霉是一种纤维素酶高产菌[15]，其菌体生长较快，产酶周期短[16]、效率高，酶系结构较为合理，可同时产生许多半纤维素酶、果胶酶和淀粉酶等，是生产纤维素酶的主要类群[4]。康宁木霉为好气菌，其菌落在PDA?平板上生长快，最初为白色致密的基质菌丝，然后出现棉絮状气生菌丝，并形成密实丛束区。其菌丝透明、有隔、壁光滑、分枝繁复，蔓延生长，广铺于固体培养基上，直径 1.5～1.8μm，分枝分生孢子由小梗相继生出面，出现在菌丝中间，靠黏液