1.1_离心技术.pptVIP

1 生化分离方法 生物化学实验中常常涉及细胞成分的生化分析或某种物质的制备，因此，必需利用有效的生物化学分离方法，常用的方法有：离心技术、层析技术、电泳技术和膜分离技术。 1.1 离心技术 1.1.1 基本原理 离心技术（centrifugal technique）是根据颗粒在作匀速圆周运动时受到一个外向的离心力的行为而发展起来的一种分离技术。 ？？？ 影响颗粒在离心场中的沉降速度的因素有： 颗粒半径rp、颗粒形状（影响摩擦力f）、颗粒与介质的密度差（?p- ? m）、一定温度条件下悬浮介质的粘度系数（?）、离心加速度?2r。 在确定的离心操作中，沉降速率则主要取决于悬浮颗粒受到离心力的大小。 ①离心力（centrifugal force，Fc）离心作用是根据在一定角度速度下作圆周运动的任何物体都受到一个向外的离心力进行的。离心力（Fc）的大小等于离心加速度ω2r与颗粒质量m的乘积，即： ω ：是旋转角速度(弧度/秒)； r ：颗粒离开旋转中心的距离(cm)； m ：质量(克)。 ②相对离心力（relative centrifugal force，RCF） 离心力因离心管至旋转轴的距离不同而不同，因此用“相对离心力” 表示离心力，若RCF值不变，一个样品可在不同的离心机上获得相同的结果。 RCF是离心场转化为重力加速度的倍数。 r：离心转子的半径距离（cm）； g：重力加速度（980cm/sec2）； rpm ：转子每分钟的转数。 Dole和Cotzias制作了与转子速度和半径相对应的离心力的转换列线图。 在用图将离心机转数换成相对离心力时，先在离心机半径标尺上取已知的离心机半径和在转数标尺上取已知的离心机转数，然后将这两点间划一条直线，在图中间RCF标尺上的交叉点，即为相应的离心力数值。 例已知离心机转数为2500rpm，离心机的半径为7.7cm，将两点连接起来交于RCF标尺，此交点500×g即是RCF值。 相对离心力(×g)RCF=1.119×10-5×r×rpm2。 1.1.2 离心分离方法 1.1.2.1 差速离心法 利用不同的粒子在离心力场中沉降的差别，在同一离心条件下，沉降速度不同，通过不断增加相对离心力，使一个非均匀混合液内的大小、形状不同的粒子分部沉淀。 操作过程中一般是在离心后用倾倒的办法把上清液与沉淀分开，然后将上清液加高转速离心，分离出第二部分沉淀，如此往复加高转速，逐级分离出所需要的物质。 差速离心的分辨率不高，沉淀系数在同一个数量级内的各种粒子不容易分开，常用于其他分离手段之前的粗制品提取。 关键是选择适合于各分离物的离心力。 例如用差速离心法分离已破碎的细胞各组份。 1.1.2.2 速率区带离心法 速率区带离心法是在离心前于离心管内先装入密度梯度介质（如蔗糖、甘油、KBr、CsCl2等），待分离的样品铺在梯度液的顶部、离心管底部或梯度层中间，同梯度液一起离心。 离心后在近旋转轴处（r1）的介质密度最小，离旋转轴最远处（r2）介质的密度最大； 但介质最大密度必须小于样品中粒子的最小密度，即ρP＞ρm。 这种方法是根据分离的粒子在梯度液中沉降速度的不同，使具有不同沉降速度的粒子处于不同的密度梯度层内分成一系列区带，达到彼此分离的目的。 1.1.2.3 等密度离心法 等密度离心法是在离心前预先配制介质的密度梯度，此种密度梯度液包含了被分离样品中所有粒子的密度，待分离的样品铺在梯度液顶上或和梯度液先混合，离心开始后，当梯度液由于离心力的作用逐渐形成底浓而管顶稀的密度梯度，与此同时原来分布均匀的粒子也发生重新分布。 当管底介质的密度大于粒子的密度，即ρm＞ρP时粒子上浮；在管顶处ρP＞ρm时，则粒子沉降，最后粒子进入到一个它本身的密度位置即ρP＝ρm，此时dx/dt为零，粒子不再移动，粒子形成纯组份的区带。 与样品粒子的密度有关，而与粒子的大小和其他参数无关。 体系到达平衡状态后，延长离心时间和提高转速也不能改变粒子的成带位置。 但提高转速可缩短达到平衡的时间，离心所需时间以最小颗粒到达等密度点（即平衡点）的时间为基准，有时长达数日。 此法一般应用于物质的大小相近，而密度差异较大时。常用的梯度液是CsCl2。 1.1.3 离心设备 离心机可为工业用和实验用离心机。实验用离心机又分为制备性和分析性离心机。 制备性离心机主要用于分离各种生物材料和分子，分离的样品容量比较大。 分析性离心机一般都带有光学系统，用于研究生物大分子和颗粒的理化性质。分析性离心机都是超速离心机。 1.1.3.1 离心机的种类 普通离心机：转速2000~6000rpm，RCF可达6000g；容量为几十毫升至几升，分离形式是固液沉降分离，转子有角式和外摆式，转速控制不严格，一般无制冷