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1 1 第9章 DNA序列测定 DNA 序列测定方法 第一节 Sanger双脱氧终止法 (chain-terminator method) 一、原理 二、DNA序列测定的策略 一、原 理 在模板指导下，聚合酶不断将dNTP加到引物的3’-OH末端，使引物延长，合成出新的互补的DNA链，如果加入双脱氧三磷酸核苷(ddNTP）,由于双脱氧核糖的3’位置上缺少一个羟基，故不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键，即形成一种全部具有相同5’-引物端和以ddNMP残基为3’端结尾的一系列长短不一片段的混合物。采用聚丙烯酰胺凝胶电泳区分长度差一个核苷酸的单链DNA，从而读取DNA的核苷酸序列。 1.双脱氧终止法测序反应体系包括： DNA聚合酶 单链DNA模板 带有3-OH末端的单链寡核苷酸引物 Mg2+ 4种dNTP(aATP,dGTP,dCTP和dTTP) 4种ddNTP(ddATP,ddGTP,ddCTP和ddTTP) 2.Sanger法DNA测序的试剂 ① 引物：通常由20-23个碱基构成，G+C=12，A+T=8到11，Tm=60-68℃，避免形成引物二聚体或形成发卡样结构 ② 模板 ③ DNA聚合酶 ④ 2′，3 ′-双脱氧核苷三磷酸 （ 2′, 3 ′-dideoxynucleoside triphosphate, ddNTP ） ⑤ dNTP 3.测序反应的种类 ① 引物标记法(Dye primer reactions) ② 终止物标记法(Dye terminator reactions) Dye primer reactions -fluorescent dye( label) on the primer, one specific dye for each nucleotide to be identified (A, C. G, T) -four separate reactions couple each specific primer with the corresponding ddNTP Dye terminator reactions - the primer is not labeled with a dye - the dye is attached to the dideoxynucleotide, so whenever a ddNTP is added by the polymerase, the fragment is labeled according to the ddNTP at the end -since labeling occurs with the addition of the ddNTP, only one reaction per template is needed 二、DNA序列测定的策略 克隆亚克隆的方法 (clone-by-clone) 全基因组散弹法(鸟枪法) (whole-genome shotgun method) 1. 方法 酶：DNA聚合酶---也可催化ddNTP连接到3′-OH，一般用Klenow大片段或T7DNA聚合酶 一般建立4个反应 原料: 模版DNA、引物、DNA聚合酶I、 ddNTP、相应dNTP（dd:d=1：10）、其它三种脱氧核苷酸以及32P或35S 步骤：4个聚合反应→同时电泳→放射自显影→测出核苷酸序列 2. 测序的策略 （一）载体和引物 载体：M13 获得单链模板 质粒（PUC） 获得双链模板 引物：克隆位点两侧的DNA序列 Genomic DNA isolation and shotgun DNA library construction. Preparation and sequencing of the DNA templates. Base calling and initial assembly. 第二节 Maxam-Gilbert化学修饰法(chemical cleavage method) 一、原理 A segment of DNA is labeled at one end with 32P. The labeled DNA is divided into four samples and each sample is treated with a chemical that specifically destroys one or two of the four bases in the DNA. The conditions of the reaction