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目 录 第一节 生物大分子的制备 第二节 几种重要的生化实验技术 第一节 生物大分子的制备 层析技术（Chromatographic Techniques）是利用混合物中各组分的理化性质（如吸附力、分子形状和大小、分子极性、分子亲和力、分配系数等）的差别，使各组分在两相中的分布不同，从而使各组分以不同速度随流动相向前移动而达到分离的目的。 离子交换层析（Ion Exchange Chromatography简称为IEC）是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。 1、离子交换树脂（母体为人工合成的高分子化合物） 2、离子交换纤维素 3、离子交换葡聚糖凝胶 离子交换纤维素的主体结构是纤维素，大部分可交换基团位于纤维素表面，易于大分子蛋白质交换。 常用的阳离子交换剂 常用的阴离子交换剂 考虑的因素包括：被分离物质所带电荷种类、分子大小、 所处环境（有否共存的其它离子）。被分离物质的物理化学性质、耐酸耐碱程度等。 1. 分离纯化小分子物质 离子交换层析也广泛的应用于无机离子、有机酸、核苷酸、氨基酸、抗生素等小分子物质的分离纯化。 2. 分离纯化生物大分子物质 离子交换层析是依据物质的带电性质的不同来进行分离纯化的，是分离纯化蛋白质等生物大分子的一种重要手段。 二、凝胶层析 凝胶层析原理示意图 分子筛层析与洗脱曲线 1、凝胶层析的基本概念 （1） 外水体积、内水体积、基质体积、柱床体积、洗脱体积 （3）排阻极限 排阻极限是指不能进入凝胶颗粒孔穴内部的最小分子的分子量。例如Sephadex G-50的排阻极限为30,000，它表示分子量大于30,000的分子都将直接从凝胶颗粒之外被洗脱出来。 （4）分级分离范围 分级分离范围表示一种凝胶适用的分离范围，对于分子量在这个范围内的分子，用这种凝胶可以得到较好的线性分离。例如Sephadex G-75对球形蛋白的分级分离范围为3,000－70,000，它表示分子量在这个范围内的球形蛋白可以通过Sephadex G-75得到较好的分离。 (5)吸水率和床体积 吸水率是指1g干的凝胶吸收水的体积或者重量，但它不包括颗粒间吸附的水份。所以它不能表示凝胶装柱后的体积。而床体积是指1g干的凝胶吸水后的最终体积。 (6)凝胶颗粒大小 层析用的凝胶一般都呈球形，颗粒的大小通常以目数（mesh）或者颗粒直径（?m）来表示。柱子的分辨率和流速都与凝胶颗粒大小有关。颗粒大，流速快，但分离效果差；颗粒小，分离效果较好，但流速慢。一般比较常用的是100－200目。 2、凝胶的种类和性质 常用凝胶主要有葡聚糖凝胶（Sephadex） 、聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide）和琼脂糖凝胶（agarose）。另外还有多孔玻璃珠、多孔硅胶、聚丙乙烯凝胶等等。 (1)葡聚糖凝胶 葡聚糖凝胶是由葡聚糖与交联剂1－氯－2,3环氧丙烷相互交联而成，是不溶于水的化学性质稳定的多孔网状球型颗粒。它的商品名为Sephadex 。 Sephadex在水溶液、盐溶液、碱溶液、弱酸溶液以及有机溶液中比较稳定的，可以多次重复使用。Sephadex稳定的pH值一般为2－10。强酸和氧化剂会使交联的糖苷键水解断裂，所以要避免Sephadex与强酸和氧化剂接触。在高温下稳定，可以煮沸消毒，在100 ?C下40 min对凝胶的结构和性能都没有明显的影响。 (2)聚丙烯酰胺凝胶 聚丙烯酰胺凝胶是丙烯酰胺（acrylamide）与甲叉双丙烯酰胺交联而成。商品名为Bio-Gel P，主要型号有Bio-Gel P-2 ? P-300等10种。P后面的数字表示的是该种凝胶排阻极限的千分之一。 聚丙烯酰胺凝胶在水溶液、盐溶液、有机溶液、酸中都比较稳定。但在较强的碱性条件下或较高的温度下，聚丙烯酰胺凝胶易发生分解。 (3)琼脂糖凝胶 琼脂糖是由D－半乳糖（D-galactose）和3,6－脱水半乳糖（anhydrogalactose）交联构成的多糖链。商品名有Agarose 。琼脂糖凝胶具有较大的孔径，排阻极限高，适合分离大一些的分子，但分辨率较低。 琼脂糖凝胶在pH值为4? 9之间是稳定的，它在室温下很稳定，琼脂糖凝胶对样品的吸附作用很小。另外琼脂糖凝胶的机械强度和孔穴的稳定性都很好。 3、凝胶的选择、处理和保存 (1)凝胶的选择 1）根据样品的情况确定一个合适的分离范 围。根据分离范围来选择合适型号的凝胶。 2）凝胶颗粒的大小 。 1）计算干胶用量：干胶用量（g）＝柱床体积（ml）/ 凝胶的床体积（ml / g）。 2）葡聚糖凝胶和丙烯酰胺凝胶干胶的处理首先是在水中膨化，不同类