酵母蔗糖酶的提取及其性质研究.ppt

1、学习酶的纯化方法，酶蛋白分离提纯的原理。 2、学习掌握细胞破壁、有机溶剂分级和离子交换柱层析技术。 本实验可以为大家提供一个较全面的实践机会，学习如何提取纯化、分析鉴定一种酶，并对这种酶的性质，尤其是动力学性质作初步的研究。 酵母蔗糖酶的提取及其性质研究 自1860年Bertholet从啤酒酵母（Sacchacomyces Cerevisiae）中发现了蔗糖酶以来，它已被广泛地进行了研究。蔗糖酶（invertase）（β-D-呋喃果糖苷果糖水解酶）（EC.3.2.1.26）特异地催化非还原糖中的β-呋喃果糖苷键水解，具有相对专一性。不仅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，也能催化棉子糖水解，生成蜜二糖和果糖。 实验原理 本实验提取啤酒酵母中的蔗糖酶。该酶以两种形式存在于酵母细胞膜的外侧和内侧，在细胞膜外细胞壁中的称之为外蔗糖酶，其活力占蔗糖酶活力的大部分，是含有50% 糖成分的糖蛋白。在细胞膜内侧细胞质中的称之为内蔗糖酶，含有少量的糖。两种酶的蛋白质部分均为双亚基，二聚体，两种形式的酶的氨基酸组成不同，外酶每个亚基比内酶多两个氨基酸，Ser和Met，它们的分子量也不同，外酶约为27万(或22万，与酵母的来源有关)，内酶约为13.5万。尽管这两种酶在组成上有较大的差别，但其底物专一性和动力学性质仍十分相似，因此，本实验未区分内酶与外酶，而且由于内酶含量很少，极难提取，本实验提取纯化的主要是外酶。 名称 MW 糖含量 亚基 为蔗糖的Km 为棉子糖的Km pI 最适pH 稳定pH 最适温度 外酶 27万 50% 双 26mM 150 mM 5.0 4.9 3.0-7.5 60℃ 内酶13.5万 ＜3% 双 25mM 150 mM 5.0 4.5 6.0-9.0 60℃ 实验中，用测定生成还原糖（葡萄糖和果糖）的量来测定蔗糖水解的速度，在给定的实验条件下，每分钟水解底物的量定为蔗糖酶的活力单位。比活力为每毫克蛋白质的活力单位数。 两种酶的性质对照表如下： 一、蔗糖酶的提取与部分纯化 二、离子交换柱层析纯化蔗糖酶 三、蔗糖酶各级分活性及蛋白质含量的测定 四、反应时间对产物形成的影响 本实验共有三个分实验： 细胞破壁的几种方法 1、高速组织捣碎：将材料配成稀糊状液，放置于筒内约1/3体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。 2、玻璃匀浆器匀浆：先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高，适用于量少和动物脏器组织。 3、反复冻融法：将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。 4、超声波处理法：用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料。 5、化学处理法：有些动物细胞，例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠（SDS）、去氧胆酸钠等细胞膜破坏，细菌细胞壁较厚，可采用溶菌酶处理效果更好。 （一）蔗糖酶的提取与部分纯化 （1）准备一个冰浴，将研钵稳妥放入冰浴中。 （2）称取2g干啤酒酵母，称10mg蜗牛酶及适量（约2g）二氧化硅，放入研钵中。二氧化硅要预先研细。 （3）量取预冷的甲苯6ml+6ml缓慢加入酵母中，边加边研磨成糊状，约需40分钟。研磨时用显微镜检查研磨的效果，至酵母细胞大部分研碎。 （4）缓慢加入预冷的20ml去离子水，每次加2ml左右，边加边研磨，至少用20分钟。以便将蔗糖酶充分转入水相。 （5）将混合物转入1个离心管中，平衡后，用高速冷冻离心机离心，4℃，4700rpm，15min。如果中间白色的脂肪层厚，说明研磨效果良好。用滴管吸出上层有机相。 操作步骤 （6）用滴管小心地取出脂肪层下面的水相，转入另一个清洁的离心管中，4℃，4700rpm，离心15min。 （7）将上清液转入量筒，量出体积，留出0.5ml测定酶活力及蛋白含量。剩余部分转入清洁离心管中。 （8）用广泛pH试纸检查清液pH，用1M乙酸将pH调至5.0，称为“粗级分I”。 2. 热处理 （1）预先将恒温水浴调到50℃，将盛有粗级分I的离心管稳妥地放入水浴中，50℃下保温30分钟，在保温过程中不断轻摇离心管。 （2）取出离心管，于冰浴中迅速冷却，用4℃，4700rpm，离心15min。 （3）将上清液转入量筒，量出体积，留出0.5ml测定酶活力及蛋白质含量（称为“热级分II”）。 3. 乙醇沉淀 将热级分II转入小烧杯中，放入冰浴（没有水的碎冰撒入少量食盐），逐滴加入等