酿酒酵母中提高乙醇产量的工程拓扑结构和蔗糖代谢动力学的研究.pptVIP

酿酒酵母中提高乙醇产量的工程拓扑结构和蔗糖代谢动力学的研究 1 简介 酿酒酵母主要以两种方式代谢蔗糖。在第一种也是占主导地位的代谢中，蔗糖被SUC2基因编码的胞外转化酶水解,水解产生的葡萄糖和果糖通过由HXT基因家族的成员编码的己糖转运子的协助扩散进入细胞。在第二种代谢中，蔗糖通过质子同向运输机制进入细胞并在胞内水解。 胞内和胞外的转化酶都是由同一基因（SUC2）编码的。 1、研究从胞外空间到胞内蔗糖水解的重新定位能否用于提高蔗糖的乙醇产量； 2、对于只能利用胞内转化酶的菌株，是否有其他步骤提高其的蔗糖利用率。 2 材料与方法 2.1 酵母菌株及保养 用于该研究的酿酒酵母菌株是CEN.PK族的同源体系。 2.2 菌株构建 参考菌株CEN.PK113-7D(SUC2) 改良iSUC2菌株IMI056、IMM007、IMM008、IMM009。 2.3 培养基和培养 预培养 ：含有100ml合成培养基的500ml摇瓶置于200 rpm的 Innova震荡培养箱中培养。 50%的蔗糖溶液在转移到培养基之前通过过滤灭菌。 厌氧培养的培养基需添加溶于乙醇的麦角甾醇（10mg/l）和吐温80（420mg/l）。 在800rpm、30℃的2L实验室生物反应器中进行厌氧恒化发酵。 有效容积用电子传感器和废水泵保持在1.0L。 pH通过自动添加2M的KOH保持在5.0。 培养过程中以500ml/min喷入氮气（10 ppm 氧气）。 在生物反应器中，使用氯化橡胶的管子和氟橡胶O型圈，培养器皿用氮气冲洗。 2.4 分析方法 将液体培养基离心处理后获得上清液、残留的糖分 上清液和培养基通过HPLC分析，HPLC用的是60℃、5mMH2SO4作为流动相，流速为0.6ml/min的Aminex HPX-87H离子交换柱。 乙醇、甘油、琥珀酸盐和乳酸盐由Waters 2410相差检测仪检测。 丙酮酸和醋酸盐是由Waters2487 紫外检测仪214nm处检测得到 蒸发得到乙醇浓缩物。 2.5 转化酶试验 在恒化器中选出细胞，冲洗两次，在冷水中重新悬浮。 胞外转化酶活性由葡萄糖发酵测得。在30℃、含有150 mM蔗糖、50 mM氟化钠50 mM Tris -丁二酸缓冲(pH 5.0) 中进行细胞孵育的。 为测转化酶总活力，细胞用乙醇、10%Triton X-100和甲苯(1:4:1)渗透，冲洗两次，并在30℃、含100mM蔗糖的50mM Tris -丁二酸缓冲(pH 5.0)中孵育。 所有试验一式三份，确保标准误差10% 2.6 蔗糖质子转运试验 蔗糖吸收中质子的转运取决于酵母悬浮液中对pH变化的记录。 酵母细胞悬浮在细胞浓度为25g/l的K -邻苯二甲酸酯缓冲液（pH 5.0）中，并存放在总体积为5ml的水夹套容器中。 悬浮物在30℃下由磁力搅拌器混合。蔗糖引起的pH变化由pH传感器监控。 为了计算质子吸收率，用100-500nmol的NaOH细胞悬浮液做一标准曲线。 蔗糖引起的最初的质子吸收率由蔗糖添加后的第一个10-20s的斜率减去蔗糖添加前的质子吸收率。 所有的实验一式三份，确保标准误差15%。 2.7 微列阵处理和分析 DNA芯片分析采用S98酵母基因芯片阵列法，细胞直接从恒化器中转移到液氮中，通过15ug完整RNA与一个环cDNA综合体试剂盒的组成成分就能合成一个双股cDNA综合体。 在试管转录之前利用基因芯片样品清理模块纯化双链cDNA，并标明是基因芯片IVT标记试剂盒。 最后，在15ug生物酰化的cRNA分裂和杂交之前用基因芯片样品净化模块纯化标记的cRNA。 阵列图像和过滤数据的采集和定量是由Affymetrix基因芯片操作系统软件（1.2版）来完成的。 添加在Microsoft Exce中的微阵列显着性分析（SAM）2.23A版本用于比较在蔗糖限制条件下IMI056和IMM007复制阵列实验。 3.1 蔗糖代谢的拓扑学：影响生物量和乙醇产量的理论分析 只采用胞内水解途径的菌株的乙醇产量的增加与采用胞外途径的菌株的产量有以下关系 （1）YSucE，intra=0.75 YSucE，extra+0.25 YSucE，max （2）R=0.75+1/ YSucE，extra 其中R= YSucE，intra / YSucE，extra 在参考菌株CEN.PK113-7D的厌氧蔗糖限制性恒化培养中，蔗糖的乙醇产量为2.96mol/mol。假设该菌株的胞内蔗糖水解作用可忽略，则乙醇产量与YSucE，extra一致。这表明胞内水解作用的转变可使乙醇产量提高8.7%。 3.2 SUC2基因工程引起胞液中转化酶的重定位 在工程菌株‘iSUC2’IMI056 和参考菌株CEN.PK113-7D(SUC2)中转化酶的定位是通过比