膜片钳.ppt

机械部件：防震台、屏蔽罩、仪器设备架，微操纵器 光学部件：显微镜、视频监视器、单色光系统， 电子部件：膜片钳放大器、刺激器、数据采集记录器 防震台、倒置显微镜、单色光发生器 膜片钳放大器、数据采集记录器、计算机、监视器 记录方式有很大的变化 应用技术不断涌现 使用的标本种类繁多 研究对象已经不局限于离子通道 膜片钳电极已经不单单是传统意义上的电信号记录电极 应用范围日趋广泛 全自动膜片钳技术的崛起 谢谢 gj 生科院 基础兽医学 1.细胞电生理学 主要内容 细胞膜的基本电特性 膜电阻 膜电容 膜的时间常数 膜的空间常数 1991 Nobel基金会的颁奖评语 膜片钳技术点燃了细胞和分子水平的生理学研究的革命之火，为细胞生理学的研究带来了一场革命性的变化，它和基因克隆技术并驾齐驱，给生命科学研究带来了巨大的前进动力。 细胞生理学：揭示细胞的生理过程，用电生理 方法记录生物电活动 1．膜电阻R ＝ r·l/S 电阻率r 高达1013－1015 Ω·cm 细胞外溶液的r 仅为60－80 Ω·cm，海水的r约为20 Ω·cm。 细胞的电阻大小并不是固定不变的，与细胞环境、生理状态、代谢水平和功能特性等有关的。 2 . 膜电容 细胞膜的脂质双分子层是电的不良导体，因而由 细胞外液-脂质双分子层-细胞内液就构成了细胞膜电容。 3．膜的时间常数 4．膜的空间常数 时间常数描述膜电压随时间的衰减，空间常数描述膜电压随空间距离的衰减。 膜片钳 膜片钳的基本原理 膜片钳的基本记录模式 膜片钳的玻璃微电极的制作 膜片钳实验系统的组成 膜片钳的发展概况 膜片钳技术：膜片钳技术是一种以记录通过离子通道的离子电流来反映细胞膜单一的或多个的离子通道分子活动的技术。 膜片钳：用玻璃微电极尖端与细胞膜封接，封接的微区称为膜片，并外接钳制电压将膜片钳位，总称膜片钳。 关于钳字 一、电压钳位 细胞膜上的电流 离子通道电流 膜电容充放电电流（消除） 用微电极将膜电压钳制到新的数值上，保持一段时间不变 使膜电容完成充放电过程进入电压钳制的稳态期， 测得的跨膜电流可以认为来自于离子通道电流。 二、小片膜可测单个通道的电流 由于玻璃微电极尖端管径很小, 离子通道数量很少,一般只有一个或几个通道,经这一个或几个通道流出的离子数量相对于整个细胞来讲很少,可以忽略,也就是说电极下的离子电流对整个细胞的静息电位的影响可以忽略,那么,只要保持电极内电位不变,则电极下的一小片细胞膜两侧的电位差就不变,从而实现电位固定。 膜片钳技术本质上也属于电压钳范畴 电压钳：1.双电极电压钳 该技术的主要缺陷是必须在细胞内插入两个电极，对细 胞损伤很大，在小细胞如中枢神经元，就难以实现，又因细胞形态复杂，很难保持细胞膜各处生物特性的一致。 主要用于巨大细胞的全性能电流的研究，特别在分子克隆的卵母细胞表达电流的鉴定中发挥着其他技术不能替代的作用。 2.单电级电压钳 膜片钳 电极电阻远小于膜片电阻 A1高增益，A2单位增益（检测） 膜片钳—电流，电压转换器 四种基本记录模式 细胞吸附式（Cell-attached mode 或 on cell mode 内膜向外式 Inside-out mode 外膜向外式 Outside-out mode 全细胞记录方式 Whole-cell recording 将两次拉制后经加热抛光的微管电极置于清洁的细胞膜表面上，形成高阻封接，在细胞膜表面隔离出一小片膜，既而通过微管电极对膜片进行电压钳制，高分辨测量膜电流，称为细胞贴附膜片。由于不破坏细胞的完整性，这种方式又称为细胞膜上的膜片记录。 高阻封接形成后，在将微管电极轻轻提起，使其与细胞分离，电极端形成密封小泡，在空气中短暂暴露几秒钟后，小泡破裂再回到溶液中就得到“内面向外”膜片。 在全细胞模式状态下将电极向上提，使电极尖端的膜片与细胞分离后又粘合在一起，此时膜内面对电极内液，膜外接触的是灌流液。可在改变细胞外液的情况下记录单通道电流。 在细胞贴附式状态下增加负压吸引或者给予电压脉冲刺激 zapping ，使电极尖端膜片在管口内破裂，即形成全细胞记录模式。此时电极内液与细胞内液相通成为和细胞内电极记录同样的状态，不仅能记