分子生物基本试验技术.docVIP

组织细胞培养 细胞传代 去除原有培养液 PBS洗一遍 胰蛋白酶消化,37℃,1-2分钟 加入新鲜的培养液，吹打至细胞分散，剩余一定比例的细胞悬液，加入一定量的新鲜培养液。 CO2温箱37℃培养 冻存细胞 去除原有培养液 PBS洗一遍 胰蛋白酶消化,37℃,1-2分钟 加入新鲜的培养液，吹打至细胞分散，收集细胞悬液至离心管中 离心，2000rpm，2分钟 去除上清，加入新鲜的培养液（10%DMSO+20%FBS） 解冻复苏细胞 将冻存细胞置于37℃水浴中，1分钟 用70%酒精消毒管口 将细胞溶液用20ml培养液稀释 离心，2000rpm，2分钟 去除上清，加入新鲜的培养液 细胞转染 Dhamafect1(DHARMACON)转染 *细胞密度：96孔板：1*10^4/孔，12孔板：1*10^5/孔，10CM盘：1*10^6/孔 SiRNA终浓度：50-100nM 12孔板 SiRNA(20μM )2.5μl/孔+去血清培养液，混匀于室温下静置5分钟 Dhamafect1试剂2μl/孔+去血清培养液，混匀于室温下静置5分钟 将100μl SiRNA混液与100μl Dhamafect1试剂混液充分混合成转染液，室温下静置20分钟 将200μl转染液加入800μl正常培养液中。 去除细胞旧的培养液，加入含有转染液的新的培养液CO2温箱37℃孵育24-48h。 Western Blot 收细胞 去除原有培养液 PBS洗一至两遍 根据细胞密度加入适量的溶胞试剂（lysis buffer）*12孔板每孔加40-60ul 刮去细胞溶液，收集在1.5ml离心管中 超声打碎细胞溶液10-20秒（Sonicate,Sonic Dismembrator） 4摄氏度离心13000rbm，8-10分钟 取上清即可 蛋白定量 *标准样品（2mg/ml）配成80，40，20，10，5，2.5ug/100ul *BCA蛋白分析试剂，A:B=50:1,100ul/well *96孔板，细胞裂解液5-10ul+H2O90-95ul 1．加入样品和BCA试剂后，37摄氏度，30分钟 2．用ELISA仪测吸光度（OD值），参照标准样品浓度得出样品浓度。 电泳 *凝胶浓度：分子量越大浓度越低 *缓冲液：Tris-Hepes-SDS Running Buffer *加样前用1ml洗头吹打加样槽，驱赶气泡 *加样时不可将吸头进入过多，以免凝胶分离 *加样缓慢，以避免气泡将样品顶出 1．根据样品蛋白定量，以最小浓度计算所需提及，并加入loading缓冲液，100摄氏度加热5-10分钟（总体积小于等于60ul） 2．电泳，100v，50-60分钟 转膜 三明治：从负极到正极依次是：海绵-滤纸-凝胶-膜-滤纸-海绵 22v过夜，60v四小时 缓冲液： 封闭 缓冲液：5%脱脂牛奶/5%小牛血清TBST 40-60分钟室温下轻摇 加入一抗 1：1000，4摄氏度，轻摇过夜 TBST洗三次，每次10-15分钟 加入二抗 1：3000，室温一小时轻摇 TBST洗三次，每次10-15分钟 曝光 免疫沉淀 *Affinity Gel 1．40ul/样品 Affinity Gel悬液，用500ul冰PBS洗两遍，离心后去除上清 2．加入约含1000ug蛋白的细胞裂解液，用水使体积达1ml 3．4摄氏度旋转混匀过夜 4．4摄氏度离心，13000rbm，去除上清，冰500ul冰PBS洗两遍，离心后去除上清 5．加入loading缓冲液80ul/管， 100摄氏度加热三分钟 6．4摄氏度离心，13000rbm，取上清至新的离心管 7．做Western Blot 96孔板XTT 细胞密度：1000/孔，次日加药，24，48，96h行XTT A50ul/well+B1ul/well+培养液100ul/well,37摄氏度4小时 492nm光谱，测od值 免疫组化（96孔板） 待测细胞，PBS洗两遍，每次5分钟，用4%paraformoldehyde(溶于PBS)室温孵育十分钟 PBS洗两遍，每次5分钟， 用1%H2O2室温孵育10-15分钟 PBS洗两遍，每次5分钟 PBST（PBS+0.1%Triton X-100）洗一遍，5-10分钟 用Diluted Normal Horse Serum(NHS)孵育20分钟封闭 加入一抗1：100溶于上封闭液中，4摄氏度孵育过夜 去除一抗溶液，PBS洗三遍，每次5分钟 用Diluted Biotinylated “universal”Secondary Ab室温孵育30分钟 PBS洗三遍，每次5分钟 用ABC试剂室温孵育30分钟 PBS洗一遍，5分钟 加入底物（30ul ImmuPACT DAB+1ml Diluent Vector Lab ImmuPACT D