HPGT基因在毕赤酵母中的表达研究.doc

  HPGT 基因在毕赤酵母中的表达研究# ** 5 10 15 20 25 30 35 40 摘要：D-对羟基苯甘氨酸是β -内酰胺类抗生素药物重要的侧链，D-羟基苯甘氨酸转氨酶 （HPGT）是 D-对羟基苯甘氨酸全生物合成途径中最为关键的构型决定酶。本实验构建了大 肠杆菌-毕赤酵母穿梭载体 pPIC9K-HPGT，将其整合至毕赤酵母染色体，进行了发酵实验， 测定转化率和酶的活性。结果表明，毕赤酵母实现了 HPGT 的有活性分泌表达,能将底物转 化为 D-对羟基苯甘氨酸,为进一步在酵母中全合成的改造奠定了基础。 关键词：合成生物学；D-对羟基苯甘氨酸；HPGT；毕赤酵母；分泌表达； 中图分类号：Q74 Expression of the HPGT gene in Pichia XU Jing, WANG Zongrui, ZHAO Guangrong (Key Laboratory of System Bioengineering, Ministry of Education,Department of Pharmaceutical Engineering, School of Chemical Engineering and Technology, Tianjin University, Tianjin 300072) Abstract: β-Lactam is one of the most widely used antibiotics. D-hydroxyphenylglycine is an important side chain of β-Lactam and it has a vital influence to the drug effect and survivability. The key in biosythesis of D-hydroxyphenylglycine is the configuration decision enzymethe Hydroxyphenylglycine transaminase (HPGT). This experiment constructed the shuttle vector pPIC9K-HPGT of E. coli and Pichia. After that, we integrated the shuttle vector pPIC9K-HPGT into the Pichia chromosome so as to realize its secretory expression. Finally we conducted fermentation of the Pichia which has been integrated with the pPIC9K-HPGT and assayed the enzyme activity and conversion rate. Statistics shows that the Pichia realized the active secretory expression of HPGT, which lay the foundation for the further research of HPGT. Key words: Synthetic Biology；D-Hydroxyphenylglycine；HPGT；Pichia；Secretory expression 0 引言 D-对羟基苯甘氨酸转氨酶 HPGT[1-4]是催化对羟基苯乙醛酸转化为 D-对羟基苯甘氨酸[5-9] 或苯乙醛酸转化为 D-苯甘氨酸途径中的一个构型决定酶，表达状况的好坏和酶活性的高低， 直接决定着最终产品合成的质量和产量，而自然界中对羟基苯甘氨酸多以 L 个构型存在， 因此 HPGT 对 D 构型[10]产物的合成有重要的意义。HPGT 基因长 1326bp，编码 442 个氨基 酸，研究证实 SDS验证纯化后的编码蛋白约 47kd。目前实验研究中所用 HPGT 基因 多取自恶臭假单胞杆菌 LW-4[11]，利用分子生物学手段克隆至克隆载体或表达载体，进行进 一步的优化和表达。 巴斯德毕赤酵母是目前广泛使用的最优秀的基因表达系统之一，它具有表达率高、遗传 稳定、产物可分泌、发酵工艺成熟以及蛋白加工、折叠、翻译后修饰等高等真核表达系统的 优点，并且操作和大肠杆菌、酿酒酵母同样简单。它比杆状病毒或哺乳动物组织培养等其他 真核表达系统更简单快捷，并且表达水平更高。毕赤酵母表达宿主菌[12]于 80 年代初开发获 得，大多应用的宿主菌是通过对野生型石油酵母 Y11430 进行突变改造而来。在组氨酸脱氢 -1-