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基因工程 第七节 重组子的筛选与鉴定 一、重组子的筛选 转化子：将导入外源DNA分子后能稳定存在的细胞称为转化子。 重组子：含有DNA分子的转化子成为重组子。 1. 根据载体选择标记基因初步筛选转化子 一般的做法是将转化处理后的受体细胞接种在合适的选择药物的培养基上在最适生长温度条件下培养一定时间，根据菌落生长的状况即可挑选出转化子。 1. 根据载体选择标记基因初步筛选转化子 选择培养基：是根据需要检测细胞的类型配制的培养基，对于细菌受体细胞而言，通常用LB培养基，在LB培养基上加入适量的某种选择药物即为选择培养基。 选择药物：由载体DNA分子上携带的选择标记基因所决定，多与标记基因的遗传表型相对应，主要有抗菌素和显色剂等。 （1）根据载体抗生素抗性基因和相应的选择药物筛选转化子 利用载体DNA分子上的抗药性选择标记基因进行的筛选方法，多用于大肠杆菌转化子的筛选。 ①氨苄青霉素：Ap或Amp，含bla基因的菌体能转译β-丙酰氨酶，可降解Ap，抗Ap菌落的选择剂为终浓度30~50ng/ml，贮存液为25mg/ml水溶液。 （1）根据载体抗生素抗性基因和相应的选择药物筛选转化子 ②氯霉素：Cm，Cmp，含Cat基因的菌体能转译氯霉素乙酰转酰基酶，使Cm乙酰化而失效。抗Cm菌落的终浓度为30μg/ml，贮存液为34mg/ml乙醇溶液。 ③卡那霉素：Km，kan，含kan抗性基因的菌体转译能修饰km的酶，阻碍Km对核糖体的干扰，抗Km菌落的终浓度为5μg/ml，贮存液为25mg/ml水溶液。 （1）根据载体抗生素抗性基因和相应的选择药物筛选转化子 ④链霉素：Sm，Str，含Str抗性基因的菌体转译一种能修饰Sm的酶，抑制Sm与核糖体的结合，抗Sm菌落的终浓度为25μg/ml，贮存液为20mg/ml水溶液。 ⑤四环素：Tc，Tet，含Tc抗性基因的菌体转译能改变细胞膜的蛋白，防止Tc进入细胞后干扰细菌蛋白质的合成，抗Tc菌落的终浓度为12.5~15.0μg/ml，含Tc培养基中不可加Mg盐，因Mg 盐拮抗Tc，贮存液为12.5mg/ml乙醇-水溶液，含Tc溶液与培养液均应在暗处存放。 （1）根据载体抗生素抗性基因和相应的选择药物筛选转化子 挑选转化子菌落时，必须根据转化处理时对照处理组菌落生长情况来定。 一般DNA对照组和感受态细胞对照组不应生长菌落，而感受态细胞有效性对照组应长菌落，如其中一项不符，就有出现假转化子菌落的可能，这样的菌落不宜作为转化子，而用于进一步实验材料。 如用Tc，Cm，Ap等选择药物，观察和确定转化子时间不宜过长13~16h为宜，否则会现假转化菌落。药物的自然降解也出现假菌落。 （2）插入失活筛选法——利用质粒载体的双抗药性继续筛选 用（1）的筛选获得的大量转化子中同时包括需要的重组子，也含有非必需的非重组子 方法：将Apr的转化子影印至含抗生素Tc的平板上。由于外源DNA片段插入载体DNA的BamHI位点导致载体Tcr基因失活，因此带选择的重组子含有Apr Tcs的遗传表型，而非重组子则为AprTcr。 即重组子只能在Ap板上形成菌落，而不能在Tc板上形成菌落，而非重组子在这两种平板上都能形成菌落，比较两种平板上对应的转化子的生长状况，即可Ap板上挑出重组子。 （3）插入表达筛选法——利用目的基因插入载体后能激活标记基因而筛选 与（2）法相反，该法是利用外源目的基因插入特定载体后能激活筛选标记基因的表达，由此进行转化子的筛选。 有些载体在设计时，在筛选标记基因年前面加上一段负调控序列，当插入失活该负调控序列时，其下游的筛选标记基因才能表达。 （4）显色筛选法 常用的显色剂是x-gal(5-溴 4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)。 具有完整的乳糖操纵子的菌体能转译β-半乳糖苷酶、透过酶和乙酰基转移酶，当培养基中存在诱导物IPTG（异丙基-β-D-半乳糖苷）和x-gal时，可产生蓝色沉淀物，使菌体成为蓝色，如果在载体DNA上组入lacZ部分缺失的片段lacZ’，则重组DNA分子转化lacZ’互补型菌株，则在含有x-gal和IPTG的培养基中得到的转化子是蓝色菌落，而lacZ’得到的转化子是白色菌落。 （5）利用报告基因筛选植物转化细胞 报告基因：在植物转基因中，载体携带的选择标记基因经常称为报告基因。 在有选择压力的情况下，可利用报告基因在受体细胞内的表达而筛选转化细胞；同时，报告基因可以和某些目的基因构成嵌合基因，通过报告基因的表达了解目的基因的表达情况及推测基因调控序列，常用的报告基因有抗生素抗性基因及编码某些酶类或其它特殊产物的基因等。 ① β-葡萄糖酸苷酶（Gus）基因 Gus基因最早是从E.coli 12中克隆出来的，能编码稳定的Gus产物。与抗生素抗性基因不同的是Gus基因并非正选择标记。 作为报