免疫毒素CCL25-PE38原核表达载体克隆及表达.docVIP

  免疫毒素 CCL25-PE38 原核表达载体克隆 及表达# 胡义，张秋萍** 5 10 15 20 25 30 35 40 （武汉大学基础医学院，武汉 430071） 摘要：目的：利用 CCR9 的特异性配体 CC 型趋化因子-25（CC chemokine 25， CCL25）和铜 绿假单胞菌外毒素 A（PEA）截短型片段 PE38 构建重组免疫毒素 CCL25-PE38，以期为 T-ALL 的靶向治疗提供基础。方法： 首先运用重叠延伸 PCR（SOE-PCR）的方法合成 CCL25 基因片 段，通过 PCR 从 pRB391 质粒克隆 PE38 基因，然后利用 SOE-PCR 方法合成免疫毒素全长基因 片段 CCL25-PE38。将合成的 CCL25-PE38、PE38 片段定向克隆至 pET32a(+)、pET30a(+)、 pcDNA3.1 构建其表达载体 pET32a(+)-CCL25-PE38/PE38、pET30a(+)-CCL25-PE38/-PE38、 pcDNA3.1-CCL25-PE38/PE38。将原核表达载体转化 E.coli Rosseta、BL21 诱导目的蛋白表 达。结果：经酶切鉴定、DNA 序列测定等证实，成功克隆了免疫毒素 CCL25-PE38 基因并获 得其原核表达载体。pET32a(+)-CCL25-PE38/PE38、pET30a(+)-CCL25-PE38/-PE38 在 E.coli Rosseta、BL21 中经 IPTG 诱导获得了表达，SDS和 Western Blot 证实目的蛋白主要以 包涵体形式表达。结论：成功克隆重组免疫毒素 CCL25-PE38 基因，免疫毒素 CCL25-PE38 能够在原核表达系统得到表达。本研究为 T-ALL 的靶向治疗提供了基础。 关键词：CCR9；CCL25；铜绿假单胞菌外毒素；急性 T 淋巴细胞白血病；免疫毒素 Expression of prokaryotic vector cloning of CCL25-PE38 immunotoxin Hu Yi, Zhang Qiuping (Basic medical Schol, Wuhan University, WuHan 430071) Abstract: Objective to construct fused exotoxin by delivering Pseudomonas exotoxin 38 (PE38) toxin fused with the specific ligand CC chemokine 25(CCL25).Methods firstly, SOE-PCR was used to clone the cDNA of CCL25 and PCR was used to clone the cDNA of PE38 from pRB391. Secondly, the PE38 moiety was fused to the C-termini of CCL25 by gene splicing by overlap extension PCR, SOE-PCR. Then the CCL25-PE38 was inserted into pET32a(+)、pET30a(+) to construct the expression vectors. The expression of interest proteins were induced by IPTG in prokaryotic expression system and then identified .Results:We demonstrated that CCL25, PE38 and CCL25-PE38 can be successfully cloned by SOE-PCR and/or PCR. The expression vectors were constructed by directed cloning CCL25-PE38 into pET32a(+)、pET30a(+). The immunotoxin CCL25-PE38 can be induced by IPTG in prokaryotic expression system, but it mainly present as protein of inclusion bodies.Conclusion:This work shows that CCL25-PE38 can be successfully constructed by gene engineering. Keywords: C