信号转导通路研究策略和常用方法.pptVIP

Y A B Y 裂解细胞 免疫沉淀蛋白质X 免疫共沉淀（Co-IP）技术 非变性条件下裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。若用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。进一步进行Western Blot和质谱分析。常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合，也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。 缺点：可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质相互作用。 Western Blot和质谱分析 Co-IP工作示意图 Co-immunoprecipitation binding wash elution Y Y Y Y Y GST融合蛋白进行Pulldown实验 GST pull-down assay 原理 将GST融合蛋白(tagged protein (标记蛋白) or the bait (饵蛋白)，GST, His6, Flag, biotin …)作为探针，与溶液中的特异性搭档蛋白(test protein, or prey被扑获蛋白)结合，然后根据谷胱甘肽琼脂糖球珠能够沉淀GST融合蛋白的能力来确定相互作用的蛋白。一般在发现抗体干扰蛋白质－蛋白质之间的相互作用时，可以启用GST沉降技术。该方法只是用于确定体外的相互作用。 GST-Pulldown Assay 转录激活因子 DNA结合结构域(BD) 转录激活结构域(AD) 酵母双杂交技术 酵母双杂交技术是一种基于转录重建而建立的研究生物大分子相互作用的简便而有效的研究方法。 在酵母细胞中分析蛋白质相互作用。 以真核细胞转录激活因子的结构为基础。 将编码某一蛋白X的DNA序列与DNA结合域BD的编码序列融合形成一个杂交体(“诱饵”bait)，将编码另一蛋白Y的DNA序列与DNA激活域AD的编码序列融合形成另一个杂交体(“猎物”或靶蛋白prey or target protein); 当两个杂交体共转化酵母细胞（此酵母细胞含有上游有DNA结合位点的报告基因），若X和Y没有相互作用，则单独不能激活报告基因的转录；若X和Y可相互作用，则使BD和AD靠近形成一个有效的转录激活子，激活报告基因的转录。因此可通过检测报告基因的转录来研究蛋白质X和Y的相互作用。但限于核内表达的蛋白质的相互作用。 酵母双杂交系统 荧光共振能量转移(FRET)是对生物大分子之间相互作用定性、定量检测的一种有效方法，是在活体细胞中实时地对生物大分子之间的相互作用进行动态监测. 两个携带不同荧光基团（如GFP、YFP、CFP等）的大分子在相互间距离足够近时会发生激发态能量非放射性地由一个荧光基团（供体）向另一个荧光基团（受体）转移的现象。如果发生FRET，则供体信号将淬灭而受体信号将激活或增强. FRET 检测系统可以快速高效地捕获来自标定分子间相互作用的短暂微弱的荧光信号，而以分子尺度分辨出供体-受体的平均距离，并能显示出受体-供体的相互作用。 蛋白质直接相互作用的荧光共振能量转移 Fluorescence Resonance Energy Transfer 以光线激发后，供体荧光基团(ECFP–X)会将激发能量转移至距离10–100 ? 以内的受体荧光基团(EGFP–Y)，使之发出荧光。通过检测受体荧光基团激发的荧光即可确认两蛋白质间的相互作用。ECFP：强化型蓝荧光蛋白；EGFP：强化型绿荧光蛋白 FRET 3. 磷酸化蛋白质研究方法: Western blot with phospho-specific antibodies. ELISA Phosphopeptide and phosphoamino acid analysis by mass spectrophotometric analysis. 激酶活性的测定 　　信号转导过程中往往涉及多种激酶的活化，因而对这些激酶活性的测定在信号转导研究中具有重要意义。常见激酶活性的测定有PTK、PKC及PI-3K等。均有商品化的试剂盒。 4. 基因转录活性检测 信号蛋白转录水平表达（mRNA）的检测: RT- PCR / Realtime RT- PCR Northern blot analysis. “gene chip” to measure changes in gene expression at larger scales. 基因启动子/增强子转录活性的检测: Transient or stable reporter assay—luciferase (Luc) . RT- PCR Marker 组1 组2 内参基因 目的基因 RT： 以polyT为引物，在逆转录