核酸分子杂交课件.pptVIP

核酸分子杂交方法及特点 3．DIG 标记探针的方法 基本方法 将DNA标本用限制性内切酶消化后，经琼脂糖凝胶电泳分离各酶解片段； 经碱变性，Tris缓冲液中和，高盐下通过毛吸作用将DNA从凝胶中转印至硝酸纤维素滤膜上，烘干固定，凝胶中DNA片段的相对位置在DNA片段转移到滤膜的过程中继续保持着。 附着在滤膜上的DNA与32P标记的探针杂交，利用放射自显影术确定探针互补的每条DNA带的位置，确定在众多酶解产物中含某一特定序列的DNA片段的位置和大小。 四、冲洗  杂交后冲洗是减低非特异性杂交的关键步骤，其SSC的浓度可低至0.1×SSC。  应用放射性核素探针时，冲洗可达几小时，而用生物素及地高辛等标记的探针冲洗时间则可缩短为15分钟。  冲洗时温度不能高于50℃，否则将导致组织细胞结构的破坏及组织或细胞从切片上脱落，使实验失败。  五、显示  核酸原位杂交结果的显示应体现特异性和敏感性。当DNA探针长度超过0.5Kb时非特异性杂交增多，本底增高。 探针与无关基因中部分同源顺序的非特异性结合亦是非特异性杂交的原因之一。 除探针的非特异性结合外，检测系统亦是导致非特异性结果的原因之一。 生物素标记的探针，常用免疫组织化学技术检测，在许多组织中因含有内