色层分离法.ppt

第一节 色层法基础理论 分配定律： 一定温度下，溶质在两相间的平衡服从分配定律. 吸附等温式 在溶液与固体接触时，实质分配的平衡关系应符合米(Langmuir)吸附等温式: 色层分离理论 溶质在层析柱(纸或板)中的移动可以用解离常数kp分离因数α，阻滞因数Rf，以及洗脱容积Ve来表征。 上式整理得： 这里，分离因数α是上述二次方程式的解，它是层析柱有效结合位子总浓度mt，溶液中溶质总浓度ct以及被结合目标物质的解离常数Kp函数。 当条件为mtct时，即与溶质分子的浓度(低浓度)相比较，有效结合位子大大过剩的情况下: 分离因数α值与溶质的浓度ct 的关系： 从方程式(22-8)可知，在同一层析系统中，〈mt ， Kp一定)分离因数α值取决于溶质的浓度ct，较高的溶质浓度往往得到较低的结合比例，而较低的溶质浓度一般有较高的α值。 从式(22-10)，式(22-11)，式(22-12)可得: 令色层分离柱的长度为L。设在t时间内流过的流动相体积为V，则流动相的体积速度为V/t 。 根据式(22-1)，溶质移动速度为： 如令LAm =Vm，层析柱中流动相体积， LAs=Vs，层析柱中固定相体积，则有: 第二节 亲和层析 概念： 亲和层析是利用特异性互作分子对而设计的。将分子对中的一种分子固定化到固体基质上，装入层析柱， 将样品上柱进行亲和吸附，洗脱除去未结合杂蛋白，最后用适当的洗脱剂洗脱，得到纯化的目标蛋白。 特异性互作分子对：酶-底物或抑制剂，抗原-抗体，激素-受体，糖蛋白与凝集素，生物素-生物素结合蛋白等。 一 基质(matrix) 需满足的条件: ①、具有亲水性，尽可能少的产生非特异性吸附； ②、具有可活化的大量化学基团用于连接配基； ③、机械强度好，能耐受操作压力，不随溶剂环境而发生显著体积缩胀； ④、稳定性好，不被生物降解，能耐受一定酸碱性和促溶剂清洗； ⑤、颗粒大小及孔径均匀，能容纳生物大分子进出，有适当流速。 商业琼脂糖介质 基质活化方法与配基耦联 5、活化基团与配基密度测定 6、亲和介质吸附容量测定 亦可按Langmiur吸附等温线法，测定亲和介质在不同浓度目标蛋白的吸附量，与平衡液中目标蛋白浓度计算目标蛋白吸附容量。其计算方程式为: 式中q*为单位体积介质吸附目标物的量；qm为单位体积介质最大吸附量；c*为吸附平衡时，溶液中游离目标物的浓度；Kd为解离常数。 在应用上式时，应当注意，样品纯度不同时，其计算得到的吸附容量会有差异。 二、 柱操作系统 柱层析系统一般有蠕动泵，层析柱，检测器，记录仪及分部收集器组成。 (1)、装柱 (2)、平衡 (3)、上样 (4)、淋洗(washing) (5)、洗脱(elution) ①、专一性洗脱(specific elution) ②、非专一性洗脱(nonspecific elution) 洗脱方法有三种: ②、分步洗脱(step elution) 当样品含杂质较多时，可先用一种洗脱缓冲液洗脱杂质。然后用更强烈的洗脱缓冲液洗脱目标物。 例如：在肝素亲和柱纯化酸性成纤维细胞因子时，用0.05mol/L，pH7.5Tris-HCl(含0.6mol/L NaCl)淋洗缓冲液，淋洗层析柱后，用相同缓冲液(含1.0mol/L NaCl)洗脱液，洗脱杂质，最后用含1.8mol/L NaCl上述缓冲液洗脱目标物，一次层析就能得到银染法电泳纯目标物。 ③、梯度洗脱(gradient elution) 连续改变洗脱液的组成可使目标物洗脱集中，避免拖尾出现。并提高分辨率，与其他成分洗脱峰分开。 (6)、层析柱清洗 第三节 染料层析 用做亲和配基的染料主要有两类,一类是Cibacron另一类是Procion。 这些染料结构中都有三嗪环，环上有一至两个可被取代的氯原子。 三嗪环可与含羟基的介质反应耦联到介质上，在介质与染料间形成醚键。 染料部分常有蒽醌或荼衍生物，含有一个或多个氨基或磺酸基。其结构类似某些酶的底物。 利用合成染料作配基用于亲和层析有很多优点。 第四节 疏水层析(hydrophorbic interaction chromatography) 将疏水性基团如丁烷、辛烷、苯固定化到介质上，这些基团会与蛋白质生物大分子上的疏水区亲和。同一疏水基团对不同蛋白质的亲和会存在差异，不同疏水基团对同一蛋白质的亲和也存在差异。 亲和作用与配基密度有很大关系。配基密度高，亲和作用强，反之则较弱。在高盐浓度中有利于亲和