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* 保加利亚乳杆菌蛋白质提取方法研究 学生姓名：黄 宇 所在院系：食品学院 所学专业：食品质量与安全 目 录 前 言 材 料 与 方 法 结 果 与 分 析 实 验 结 论 东北农业大学 1 2 3 4 前 言 东北农业大学 以裂解液为提取介质，分别采用反复冻融、超声破碎以及玻璃珠破碎3种方法提取细菌蛋白质，通过分析细菌破碎程度、蛋白质SDS电泳及蛋白质浓度测定，比较各提取方法的效果。筛选出一种稳定有效的保加利亚乳杆菌的蛋白质提取方法。 实 验 材 料 东北农业大学 菌种 设备 无菌工作台、全自动高压灭菌锅、生物显微镜 、离心机、天平 、真空冷冻干燥机、紫外可见分光光度计、超声细胞破碎仪、pH计、微量进样器。 试剂 十二烷基硫酸钠、SDS低分子量标准蛋白、β-巯基乙醇、EDTA 、丙烯酰胺、30%丙烯酰胺溶液、甘氨酸、MRS培养基和蛋白质电泳储备液等。 德氏乳杆菌保加利亚亚种(乳品科学教育部重点实验室提供)。 实 验 方 法 东北农业大学 保加利亚乳杆菌生长曲线的建立 菌株活化、保加利亚乳杆菌生长曲线的建立 无细胞提取物的制备 超声破碎法：将细菌沉淀加入裂解液，在冰浴中用超声波破碎仪破壁。离心，得到无细胞提取物。 反复冻融法：将细菌沉淀加入裂解液，液氮中反复冻融后，离心取上清液备用。 玻璃珠法：将细菌沉淀加入裂解液，放入适量酸洗玻璃珠，冰浴。高速涡旋振荡得到无细胞提取物。 实 验 方 法 东北农业大学 细菌裂解程度观察 涂片→晾干→固定→染色→水洗→煤染→脱色→复染 蛋白质定量 BCA试剂盒(碧云天)测定蛋白质浓度 ,根据标准曲线计算出样品的蛋白浓度。 SDS蛋白电泳 垂直平板电泳槽的安装→分离胶的制备→浓缩胶的制备→样品处理及加样→电泳→染色及脱色 菌 株 活 化 东北农业大学 11 % (w/v) 脱脂乳培养基，37℃，培养36 h后，凝固，革兰氏染色镜检观察结果(如图)，菌种纯，活力高，可用于下步实验。 保加利亚乳杆菌生长曲线的建立 东北农业大学 保加利亚乳杆菌在MRS培养基中不同培养时间下的吸光值，并绘制其生长曲线。结果如图，保加利亚乳杆菌在5 h左右进入对数生长期，在12 h左右进入对数生长末期，16 h左右进入稳定期。 细菌破碎程度分析 东北农业大学 超声破碎法处理保加利亚乳杆菌 玻璃珠法处理保加利亚乳杆菌 反复冻融法处理保加利亚乳杆菌 镜下观察，玻璃珠法中细菌的破碎程度与超声破碎法相近，略低于超声破碎法。仍有少量杆状未被充分破碎。反复冻融法中细菌破碎程度明显低于玻璃珠法和超声法，有较多菌体仍然呈杆状未破碎，说明反复冻融法强度不够，不能使保加利亚乳杆菌充分破碎释放出蛋白质。 蛋白质标准曲线 东北农业大学 蛋白质质量浓度测定 东北农业大学 0.67 0.22 1.73 BCA试剂盒法 玻璃珠法 反复冻融法 超声破碎法 测定方法 不同方法提取的保加利亚乳杆菌蛋白质质量浓度(μg/uL) 由表可以看出，超声破碎法提取的蛋白质质量浓度最高，其次为玻璃珠法，反复冻融法提取的蛋白质质量浓度最低，进一步验证了实验结果。 *