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第36卷 分析化学(FENXIHUAXUE)研究报告 第8期 Chinese of 1024～1028 2008年8月 JournalAnalyticalChemistry 生物催化生成对苯二甲酸微生物协同作用的代谢途径分析 桑萍12田晶“，2 高鹏2 许国旺2 ‘(大连工业大学，大连116034) 2(中国科学院大连化学物理研究所国家色谱研究分析中心，大连116023) 摘要建立了对苯二甲酸、对甲基苯甲醛、对甲基苯甲醇、对甲基苯甲酸的高效液相色谱分析方法。采用 moi／L HypersilSAX阴离子交换柱，流动相为2．5 NH4H2P04(含10％乙腈)，pH4．32，流速0．8mL／min，柱温 min内得到很好地分离，回收率符合测定要求。 30℃。紫外检测波长为254nm。在此色谱条件下，各组分在7 运用本方法测定了睾丸酮丛毛单胞菌和嗜麦芽窄食单胞菌生物催化生成对苯二甲酸不同发酵时间发酵液中 主要代谢物含量。同时，采用GC—MS方法检测了有机酸、氨基酸、糖及长链脂肪酸等胞内代谢物，结合HPLC 和GC．MS检测结果，分析了嗜麦芽窄食单胞菌和睾丸酮丛毛单胞菌协同作用催化对二甲苯生成对苯二甲酸 的代谢途径。 关键词对苯二甲酸，高效液相色谱，生物催化，睾丸酮丛毛单胞菌，嗜麦芽窄食单胞菌 1 引 言 对苯二甲酸(PTA)是一种重要的化工原料，广泛应用于塑料、化学纤维、高分子等生产过程中，全球 需求量很大【lJ。其传统生产方式主要采用化学合成法，该方法消耗能源巨大、对反应设备要求苛刻、原 料消耗和水资源消耗较高、污染物排放和污染扩散较大呤’3J。生物催化技术采用酶来催化化学过程，是 实现化学工业可持续发展最有效的技术。它的特点是反应条件温和、底物选择性和化学选择性高、环境 单加氧酶及二甲苯氧化酶来催化PX¨l12】。本实验采用生物催化转化法生产PTA，已从土壤中筛选到 能够利用Px生成m的菌株，经鉴定为嗜麦芽窄食单胞菌和睾丸酮丛毛单胞菌的混合株¨引。进一步 明确该两株菌催化PX合成PTA的作用机理和相关代谢途径，为开展生物催化转化法生产PTA的研究 奠定基础。 在生物催化PX生成PTA过程中，主要代谢产物有对甲基苯甲醇(P—MBA)、对甲基苯甲醛 针对这4种代谢物的特点，建立了一种采用强阴离子柱的HPLC分析方法，能够快速准确地分离和定量 微生物催化转化PX生成PTA过程中4种主要代谢产物。结合GC—MS对胞内代谢物的鉴定，分析了嗜 麦芽窄食单胞菌和睾丸酮丛毛单胞菌协同作用催化PX生成PTA的代谢途径。 2 实验部分 2．1仪器和试剂 Waters2695高效液相色谱仪(美国Waters公司)，Waters2487紫外检测器；UV-2450紫外分光光度 造有限公司)；ZHJH一1112垂直流超净工作台(上海智城分析仪器制造有限公司)；舒美KQI18超声波清 2007—1 l·19收稿；2008-03-20接受 ·E-mail：jingtian0306@hotmail．corn 万方数据 第8期 桑萍等：生物催化生成对苯二甲酸微生物协同作用的代谢途径分析 1025 洗器(昆山市超声电子有限公司)；AE100电子天平(梅特勒一托利多仪器有限公司)；BiofugeStratos高 速冷冻离心机(德国Kendro公司)；FREEZONE QP2010(日本岛津公司)。 谱纯)；NH。H：PO。(沈阳联邦公司，分析纯)；睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonastesws据roni)，嗜麦芽窄食单 胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)从土壤中分离得到；实验用水为Milli—Q高纯水。 2．2培养基的制备 5 细菌培养基(LB营养肉汤培养基)：NaClg／L，牛肉膏5g／L，蛋白胨10