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* * 第三节 DNA测序技术 DNA Sequencing 一 简介 二 DNA自动测序仪 三 下一代DNA测序技术 四 DNA测序的应用 第三节 DNA测序技术 一、简介 1. 测序技术的建立 DNA测序即核酸DNA分子一级结构的测定，是现代分子生物学一项重要的技术。 　　 1963年，Sanger等人第一次完成胰岛素51个氨基酸的序列测定，这在当时来说是一件了不起的大事。70年代后期，Sanger和Maxam----Gilbert等人又建立了核酸序列测定的方法，Sanger双脱氧链终止法和Maxam----Gilbert化学裂解法将核酸序列测定技术推进到“直读”阶段，使核酸序列测定变得远比蛋白质氨基酸序列测定容易，这样人们可以通过核酸序列和遗传密码推导出蛋白质氨基酸的序列。 2化学裂解法(Maxam-Gillbert法) 基于某些化学试剂可以使DNA链在1个或2个碱基处发生专一性断裂的特性，精确地控制反应强度，使一个断裂点仅存在于少数分子中，不同分子在不同位点断裂，从而获得一系列大小不同的DNA片段，将这些片段经电泳分离。 分析前，用同位素标记DNA的5′末端，经放射自显影即可在X胶片上读出DNA链的序列。 3 双脱氧链终止法 读出模板互补序列 dNTP 凝胶电泳 较大片段 较小片段 ddGTP ddATP ddCTP ddTTP 反应混合物 Klenow酶 未知序列的单链DNA 读出待测序列 CTGACTTCGACAAAGAA 5′ 3′ A C T G ddG ddG ddG ddG GACTGAAGCTGTT 3′ 5′ CTGACTTCGACAA 5′ 3′ 二 DNA 自动测序 基于 Sanger 双脱氧链终止法的原理，只不过 用四种不同的荧光染料分别标记 ddATP、ddTTP、ddCTP、ddGTP 。 这四种荧光染料在激光激发下发出不同波长的荧光，因而每一种荧光代表一种碱基。 延伸中的 DNA 互补链分别终止于不同荧光标记的 ddATP、ddTTP、ddCTP、ddGTP 目前所用自动测序技术的改进同位素标记到荧光标记,平板电泳到毛细管电泳 多色荧光标记 毛细管电泳 单色荧光标记 平板电泳 同位素标记 平板电泳 A C G T A C G T 测序图谱 T A TTG CAT TG TC TGCATTG T C T DNA测序仪示意图 computer analysis 凝胶中DNA移动方向 样品槽 激光器 输入光学系统 成象透镜 聚焦透镜 高灵敏度相机 旋光镜/棱镜组件 DNA自动测序结果举例 目前商品化生产的最先进测序仪为ABI3730测序仪，最长可以测1200个碱基 目前所用测序技术的缺点 1、测序的原理是DNA链终止法，这注定了一个反应所测序列不可能太长，目前为1000个核苷酸左右。 2、测序反应费时费力 科学家们完成第一个人类基因组测序整整花了13年的时间，耗费了30亿美元的费用。 3、测序准确度不高 DNA聚合酶造成的碱基错配，DNA序列判读错误。 4、测序基于PCR反应，需要引物，并且有些些结构复杂的难于进行PCR反应的片段不能测序。 能否直接观测DNA的序列？ NO！！！ 三 下一代DNA测序技术 崭新的纳米技术测序法 Real-time DNA Sequencing 一个20年来最具爆炸性的消息 DNA测序的里程碑 将基因组的DNA断开成许多很小的片段，这些小DNA片段制成溶液后滴入测序仪内的金属薄片上，金属薄片中分布着3000个纳米级小孔，这些纳米孔的直径不到70纳米，被滴入薄片上后，小DNA片段会分散到不同的纳米孔中一旦DNA片段在纳米孔中分散完毕，向聚合酶分子滴入经过特殊处理的核苷酸溶液，谜底就会被揭开。核苷酸溶液中的每个核苷酸都用磷光染色剂做过标记，金属薄片的底部也有一个缩微版光谱仪，一旦DNA片段中有核苷酸与之配对，标记物就会发出特定颜色的光，缩微版光谱仪就能检测并记录下这些闪光，测序仪从而记录下每个DNA片段中的碱基对顺序。 Real-time DNA Sequencing的原理 这种方法读取长度大于4000碱基，达到99.3%的精确度。到目前为止，研究小组建造了一个包容3000 ZMWs(导波器)的芯片，公司希望能在2010年推向市场。到2013年，单一芯片上将能浓缩1百万ZMWs，芯片同时能观察DNA组装。Pacific创始人Stephen Turner估计，这样一个芯片将能在半小时内测序完人类的基因组，精确度99.999%，所需费用不到1000美元。 Real-time DNA Sequencing的发展前景 四 DNA测序技术的应用 分析基因组核苷