核酸分离与PCR.pptVIP

核酸包括DNA、RNA两种分子，在细胞中都是以与蛋白质结合的状态存在； 真核生物的染色体DNA为双链线性分子； 原核生物的“染色体”、质粒及真核细胞器DNA为双链环状分子； 有些噬菌体DNA有时为单链环状分子； 病毒的DNA、RNA分子，其存在形式多种多样，有双链环状、单链环状、双链线状及单链线状等。 DNA、RNA和核苷酸都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂。 DNA钠盐在水中为10g/L，呈黏性胶体溶液。 RNA钠盐在水中溶解度可达40g/L。 (1)浓盐法 利用RNP和DNP在电解溶液中溶解度不同，将二者分离。 1）用1M 氯化钠提取,得到的DNP粘液; 2) 与含有少量辛醇的氯仿一起摇荡,使乳化; 3) 离心除去蛋白质,此时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间，而DNA位于上层水相中; 4) 用2倍体积95%乙醇可将DNA 钠盐沉淀出来. （2）阴离子去污剂法: 用SDS或二甲苯酸钠等去污剂使蛋白质变性,可以直接从生物材料中提取DNA。 由于细胞中DNA与蛋白质之间常借静电引力或配位键结合,而阴离子去污剂能够破坏这种价键,所以常用阴离子去污剂提取DNA。 （3）苯酚抽提法: 苯酚是蛋白变性剂,同时抑制了DNase活性。 用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与DNA 连接键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶，蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。 利用核酸不溶于醇的性质，用乙醇沉淀DNA 。此法的特点是使提取的DNA保持天然状态 。 DNA提取举例： 高速冷冻离心机、台式离心机、恒温水浴、低温冰箱或冰柜、冷冻真空干燥器、取液器、电泳仪、水平电泳槽、紫外分光光度计。 细胞裂解液（100mM Tris-HCl 5mM EDTA 500mM NaCl 1% SDS pH 7.5）； 酚/氯仿/异戊醇 氯仿/异戊醇；无水乙醇； 70%及无水乙醇； 3M NaAC（pH5.2）； RNA酶； TAE缓冲液 动植物材料10g(鲜组织) 0.5g(干冻组织) ??? 在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物增加完全同步。 SYBR荧光染料： Bio-rad iCycler扩增曲线 扩增曲线 PE-5700扩增曲线 PE-7700扩增曲线 样本扩增曲线与阈值线交叉点的循环数 Ct值 Ct值 荧光PCR定量的原理 Unknown 未知样本拷贝数的确定 1) 全封闭反应，无需PCR后处理 2) 特异性强，灵敏度高 3) 采用对数期分析，摒弃终点数据，定量准确 4) 定量范围宽，可达到10个数量级 5) 仪器在线式实时监测，结果直观，避免人为判断 6) 可实现一管双检或多检 7) 操作安全，缩短时间，提高效率 8) 利于自动化和联网管理 荧光PCR主要优点： Rotor-Gene3000 Advanced荧光实时定量PCR仪 , Corbett Research公司 ABI Prism 7300型荧光定量PCR仪 （一）目的基因的克隆 （二）基因的体外突变 （三）DNA和RNA的微量分析 （四）DNA序列测定 （五）基因突变分析 4.PCR的主要用途 * RNA 一、核酸的分离纯化 DNA 核酸的存在形式： 核酸的理化性质 在酸性溶液中，DNA、RNA易水解，在中性或弱碱性溶液中较稳定。 DNA溶液的粘度很大，而RNA溶液的粘度小得多。核酸发生变性或降解后其粘度降低。 核酸提取的原理: 1）破碎细胞； 2）去除与核酸结合的蛋白质以及多糖、脂类等生物大分子； 3）去除其它不需要的核酸分子； 4）沉淀核酸，去除盐类，有机溶剂等杂质 细胞的破碎: ①机械方法：超声波处理法、研磨法、匀浆法 ②化学试剂法：用SDS处理细胞； ③酶解法：加入溶菌酶或蜗牛酶，都可使细胞壁破碎。 DNA提取的几种方法 1：基因组总DNA的大量提取 液氮研磨动植物组织、裂解液裂解细胞、有机溶剂抽提，使进入水相的核酸与蛋白成分分开，在RNA酶作用下，降解RNA。 仪器：? 试剂 ： 液氮，研碎 10ml裂解液 加入等体积酚/氯仿/异戊醇颠倒混匀 (55℃消化，每10min颠倒混匀一次 ) 离心(12000xg, 10min ) 上清液加入等体积酚/氯仿/异戊醇颠倒混匀 步骤： 离心(12000xg, 10min ) 上清液 2倍体积无水乙醇 (0.1体积3MpH5,2乙酸钠） 挑取絮状体或者离心得到沉淀 （70%冷乙醇洗涤,室温干燥 ） 适量TE(或水)溶解，加入10ulRNa