干血片苯丙氨酸荧光测定法.pptVIP

干血片苯丙氨酸荧光测定法 佛山市新生儿疾病筛查中心 刘海平 一、苯丙酮尿症筛查的实验方法 自从1934年挪威Folling报告苯丙酮尿症（PKU）后，实验检测方法也 越来越多，越来越先进，最早 的是1961年美国的Guthrie 建立的三氯化铁试验。 一、苯丙酮尿症筛查的实验方法 目前用于PKU筛查的方法主要有：1.荧光分析法；2.细菌抑制法；3.?酶法；4.高效液相色谱法；5.氨基酸分析法； 6.高效毛细管电泳法。目前我国苯丙酮尿症筛查的实验方法主要是荧光分析法和细菌抑制法。我们省大都使用荧光分析法。 苯丙氨酸 荧光测定法 一、原 理 1、原 理 从干滤纸血片上先提取出的苯丙氨酸，与茚三酮形成一种荧光化合物。 1、原 理 加入二肽L亮氨酸—L丙氨酸后可大大提高此荧光反应。 1、原 理 荧光 化合物 1、原 理 更稳定 荧光 化合物 2、特点 苯丙氨酸的荧光测定法是McCaman和Robins在1962年建立的测定法，故又称McCaman和Robins法。 四十年来不断改正和完善，现已有专门的荧光检测仪及相配套的试剂盒。 ①、它比细菌抑制法更灵敏、更快速、 操作更方便。 绝大多数国家和地区使用此方法， 并延续至今。 2、特点 ②荧光法测定苯丙氨酸含量结果可靠，批内和批间变异系数(CV)均小于10％。 ③商业试剂盒的苯丙氨酸检测低限为0.5mg/dl (30umol/L)。 ④血胆红素浓度小于200umol／L时对实验结果无干扰。 2、特点 ⑤通过严格控制pH值可最大程度地降低其他氨基酸的干扰。在pH5.8土0.1条件下，L甲硫氨酸、L半胱氨酸、L谷氨酸、L组氨酸、L亮氨酸和L—甘氨酸对L苯丙氨酸含量的测定无影响。 2、特点 各种改进后的荧光测定法（McCaman和Robins法）已广泛用于血清和干血滤纸标本中的苯丙氨酸定量测定。 由芬兰Labsystems公司首先推出基于现代微 量反应板的荧光测定法（McCaman和 Robins法）测定干血斑中苯丙氨酸 含量的方法，适用于大规模新生儿疾 病筛查。 二、仪器和试剂 1、仪器 1、仪器 ①、荧光读数仪；②、孵育／振荡仪；③、3mm打孔器，或打孔钳；④、加样器；八道加样器。 ⑤、3mm实验血片塑料支架；以上仪器均由芬兰Labsystems公司提供。 ⑥、电脑、打印机；⑦、冰箱。 2、试剂 三、实验操作 3．实验操作步骤 (1)做好实验登记，包括检测日期、检测区间、复查样本号等。 编写好实验操作卡；把本次实验要做的标准、 质控、复查标本、召回再查标本及常规标本 的卡片号用不同的颜色写在操作卡，看上 去一 目了然，严防打孔时张冠李戴。 佛山市新生儿疾病筛查中心实验操作卡 检测项目: PKU 检测时间: 2004年11月11日 操作者： PKU实验操作流程 四、结果判断 4．结果判断 (1)利用电脑酶标工作软件（荧光仪配有），自动处理绘制标准曲线(标准品)，计算标本的苯丙氨酸的浓度，判断结果。 4．结果判断 (2)手工计算：①在绘图纸上绘制标准曲线，纵坐标为荧光值，横坐标为标准品苯丙氨酸的浓度；②从标准曲线上读取质控和标本的苯丙氨的浓度。③质量控制值：每套试剂盒内都有一份质控的期望值； 4．结果判断 ④临界值：正常人血苯丙氨酸浓度2mg／dl。高于或接近临界值的标本需复测。建议每个实验室设定自己的临界值。 5、注意事项 5．操作注意事项 (1)实验室应清洁干净，无灰尘。防上血片及反应板被水污染。否则会使结果偏高。 (2)血片质量应符合要求，采血前一定要喂奶六次以上， 有足够的蛋白质负荷，否则会出现假阴性，另 外小孩在输液特别是输氨基酸及蛋白之类 等液体时不要马上采血，不然 会出现 假阳性 5．操作注意事项 (3)仔细阅读试剂盒使用说明书