重组小鼠精子特异蛋白抗原Catsper1S1-S6在毕赤酵母中表达的初步研究.pdfVIP

摘 要 目 的 CatSper1 是一类特异表达于睾丸组织的潜在离子通道蛋白，仅位于成 熟精子尾部主段，具有六个跨膜肽段（S ～S ），与体细胞电压依赖性钙离子通 1 6 道的一个亚单位的一个功能区结构相似。敲除该基因的小鼠精子运动能力显著 下降而且不育，因此 CatSper1 是一个潜在的避孕疫苗靶抗原。本研究旨在用基 因工程方法构建带有分泌信号肽基因的重组质粒 pPICZαA-Catsper1S1-S6 ，导入 毕赤酵母中进行表达，以获得具有免疫活性的 CatSper1S1-S6 蛋白，为进一步的 研究积累资料。 方 法 以成年雄鼠睾丸组织总 RNA 为模板，RT －PCR 扩增 CatSper1S1-S6 基 因片段（958bp-1749bp ）。用EcoR I 和 Sal I 对目的基因片段和载体 pPICZαA 进 行双酶切，酶切产物经连接后导入大肠杆菌 DH5α 感受态细胞中。筛选阳性单 克隆，PCR 初步鉴定后抽提重组质粒 pPICZαA-Catsper1S1-S6 。EcoR I 、Sal I 双 酶切及测序鉴定重组质粒以确定目的基因片段正确插入载体。获得正确的重组 质粒后，Sac I 线性化该质粒，电穿孔导入毕赤酵母 GS115，在含有Zeocin 抗性 板上筛选阳性单克隆。大量培养阳性单克隆，并用甲醇诱导表达。表达的上清 液经镍离子螯合层析纯化后，用 SDS和 Western blotting 对目的蛋白进行 鉴定。 结 果 RT-PCR 结果显示从小鼠睾丸组织中扩增的目的基因片段大小与理论 值一致；双酶切鉴定、测序结果证实目的基因片段正确插入到载体 pPICZαA 中； SDS和 Western blotting 鉴定表明获得分子量约为 43kD 的重组 CatSper1S1-S6 成分。 结 论 成功构建重组质粒 pPICZαA-Catsper1S1-S6 ；获得GS115-Catsper1S1-S6 表 达菌株；重组 Catsper1S1-S6 蛋白在毕赤酵母中实现了分泌表达。 关键词：CatSper1，巴氏毕赤酵母，分泌表达，亲和层析，精子避孕疫苗，钙 离子通道 Abstract AIM CatSper1 is a putative sperm cation channel which is specifically located in the principal piece of the sperm tail and expressed in spermary. Its structure resembles a single, six-transmembrane-spanning repeat of the voltage-dependent Ca2+ channel four repeat structure. Targeted disruption of this gene results in remarkable decrease of sperm motility and male sterility. CatSper1 represents an excellent target for contraceptives. In this study, we constructed a recombinant plasmid pPICZαA-Catsper1S1-S6.and built an expression and purification system in order to obtain the active 6his-tag fused Catsper1S1-S6 protein for further study. METHODS The total RNA extracted from mouse testis was used as template to am