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新型荧光蛋白的筛选、表达与性质研究1 叶会，张佳宁，郭江峰，易科，孙婷婷 浙江理工大学生命科学学院，杭州（310018 ） E-mail: jfguo@ 摘 要：利用合成生物学的方法，构建得到B1--B12 、E1--E8 、G1--G12、H1--H12 四个系 列共44 种质粒，经筛选得到E6 与B11 两种分别呈粉红色和黄绿色的新型荧光蛋白，对其 诱导表达最佳条件、荧光强度随时间变化及荧光蛋白表达量随时间变化等性质进行了研究。 利用正交试验得出E6 蛋白最佳表达表达条件为OD600=0.7 ，IPTG=1mM ，T=37℃；B11 蛋 白的最佳表达条件为OD600=0.5 ，IPTG=0.5mM ，T=30℃。在最佳诱导表达条件下，E6 在诱 导表达 10h 后生长趋于稳定，B11 在8h 后生长趋于稳定；荧光蛋白的荧光强度会随时间发 生变化，研究表明，两种荧光蛋白在加入诱导表达抑制剂10h 时，荧光强度最强。荧光蛋白 的表达量在诱导培养20h 时最大。对纯化后的蛋白进行了光谱性质的测定，E6 激发光波长 为538nm，发射光波长为558nm；B11 激发光波长为484nm ，发射光波长为508nm。 关键词：新型荧光蛋白；合成生物学；荧光强度 中图分类号：Q816 1. 引言 荧光蛋白作为一种新型、方便的报告基因，具有灵敏度高、在细胞内表达稳定、不需要 添加任何底物或辅助因子、无需测定酶活性等特点，已成为目前优良的标记基因之一，已在 [1] [2] [3,4] 许多领域中应用，如在蛋白质相互作用和构象变化 、蛋白质表达 、蛋白质和细胞示踪 、 [5] [6] 疾病治疗 和生态监测中的应用 等。但在某些方面，目前的荧光蛋白信号还较弱，且对细 胞正常活动有一定的影响，例如GFP可以抑制由RING类E3介导的多聚泛素化作用；drFP583 存在寡聚化、成熟过程缓慢和对细胞有毒性等问题。因此，寻找功能强大、特性优良的新型 荧光蛋白仍是一项重要的研究工作。 自1962年下村修发现荧光蛋白以来，对荧光蛋白的研究已经历时将近五十载[7] 。人们对 荧光蛋白基因做了不断地改进，方法主要有[8] ：除去基因中隐蔽剪接位点或隐蔽型内含子； 消除编码蛋白的积累；将荧光蛋白定位到特定细胞器中；改变碱基组分；更换荧光蛋白生色 团氨基酸；插入内含子；增加增强子和更换强启动子。 合成生物学是以人工方法设计和构建自然界中不存在的生物系统，用以解决能源、材料、 健康、经济和环境等诸多领域的问题[9] 。本实验室与美国休斯顿大学合作，利用合成生物学 方法，根据已知的基因序列，设计生物芯片，从小到大合成目的基因，得到B1--B12 、E1--E8 、 G1--G12、H1--H12 四个系列共44种基因序列。将其导入pET-28a （+ ）质粒后，进行抗性筛 选，从而得到真正能表达新型荧光蛋白的质粒。 筛选出新型荧光蛋白质粒后，对荧光蛋白的最佳表达条件、菌体生长状况随时间的影响、 荧光强度随时间变化[10]及荧光蛋白表达量随时间变化及其荧光光谱特性等方面进行了研 究。 1 本课题得到浙江省生物医学工程重中之重学科人才基金、浙江省大学生科技创新活动计划（浙教高教 2009[30]号）资助。 - 1 - 2. 材料和方法 2.1 材料 FP 070933 全长序列由美国休斯顿大学高晓莲教授提供，BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ限制性内切 酶、T4 DNA 连接酶购自NEB 公司，质粒提取试剂盒购自博大泰克公司，E.coli BL21 （DE3 ） 菌株由本实验室保存，IPTG、卡那霉素（kan ）、氯霉素、四环素、氨苄青霉素和Ni 柱购 自上海瑞基生物科技有限公司