基质辅助的组氨酸标签蛋白重折叠的优化.pdfVIP

基质辅助的组氨酸-标签蛋白重折叠的优化 T. Dashivets1, N. Wood2, C. Hergersberg2, . Danielsson3, J. Buchner1, and M. Haslbeck1* 1 Department Chemie, Lehrstuhl für Biotechnologie, 慕尼黑工业大学, D-85747加尔兴, 德国 2 Biosciences Technologies, GE 全球研究中心, Niskayuna, 纽约, 12309, USA 3 GE Healthcare, 乌普萨拉，瑞典 * 通讯作者：Martin Haslbeck E-mail ：martin.haslbeck@ch.tum.de 重组蛋白表达过程中不恰当的折叠会导致蛋白聚集，并 表1.用于重折叠条件的组氨酸标签蛋白 形成包涵体，这也是蛋白科学领域中一个主要的瓶颈。 这里，我们讲述了一种快速的平行方法，即基质辅助的 蛋白 分子量 等电点 四级结构 重组组氨酸标签蛋白重折叠法。基质辅助的重折叠可通 (Mr) (PI) TM FF 96孔板进行优化，随后可放大至 过His MultiTrap 增强型绿色荧光蛋白 28000 5.7 单体 HisTrap FF柱。该方法可对五种不同的蛋白进行有效地再 (eGFP) 折叠，这其中包括有单体和寡聚蛋白。对于测试的五种 铁氧还蛋白NADP+还原 35000 6.2 单体 蛋白，基质辅助的重折叠策略证实具有和溶液重折叠策 酶(FNR) 略相同甚至更好的效果。 柠檬酸合酶(CS) 49000 8.1 二聚体 葡萄糖激酶(GLK) 35000 6.1 二聚体 介绍 β-半乳糖苷酶(β-Gal) 11600 5.3 四聚体 当蛋白生成处于非生理状态下的高水平时，由于疏水结 构的暴露以及分子伴侣和折叠催化剂的失衡导致折叠和 聚集之间产生竞争(1) 。在这种状态下，目标蛋白存在于 不溶性的包涵体中。然而在整个蛋白生产策略中，目标 蛋白在包涵体中的沉积是非常具有优势的。在这里过表 达的蛋白被高度富集并且高水平的外源性目标蛋白的潜 在毒性也受到抑制。 包涵体 目前还没有一种常规的合理的用于蛋白重折叠的策略。 对于每种特定蛋白，其影响重折叠的一些具有高度多样 化的参数必需经过试验进行调整和测试(2) 。基于稀释法 进行重折叠的策略还是主流(3) ，然而它的问题是最终会 产生大量的稀释了的蛋白溶液(μg/ml) 。因此迫切需要一种 溶解 通用的可使蛋白在高浓度水平进行重折叠的方法。 这里，我们讲述一种循序渐进的策略(图1)，可以对固定 未折叠蛋白 好的组氨酸标签蛋白进行快速有效地重折叠(4) 。 材料与方法 候选蛋白见表1。为了使过程中所用到的缓冲液最小化， 我们建立一种新的，循序渐进的优化策略(表1)。通过His 逐步优化： MultiTrap FF 板将未折叠蛋白溶解并分散在96孔板中。当 1. PH 所有的上样孔处于变性条件后，基质上的蛋白采用不同 2. 盐选择/浓度 的重折叠缓冲液进行孵育。最初，当离子强度和添加剂 3. 添加剂 被优化后对缓冲液系统和PH进行改变。每一步后具有最 高重折叠效率的条件被选择用于下一轮筛