II人类蛋白质相互作用的研究策略.pdfVIP

生生命命奥奥秘秘 wwwwww..lliiffeeoommiiccss..ccoomm II 人类蛋白质相互作用的研究策略 1 大规模蛋白质质谱分析[1,2] [3] 质谱分析用于蛋白质的研究具有许多优点 ，如灵敏度高，能为极微量的样品提供信息；与色谱联用， 适用于复杂体系中痕量物质的鉴定或结构测定。总的来说，质谱分析具有准确性高、操作简易、快速等优 点。 1.1 质谱分析的方法主要有下列几种： 66 样品分子可以与碱金属离子加合，如[M+Na]和[M+K] ，这种加合方式有助于形成离子，而这种现象则有 助于生物分子的离子化。 因此，使用氯化钠溶液对样品表面进行处理有助于提高加合离子的得率。在分析过程中加热样品也有助 于提高得率。在FA B离子化过程中，可同时生成正负两种离子，这两种离子都可以进行质谱分析。样品分子 如带有强电子捕获结构，特别是带有卤素原子，则可以产生大量的负离子。 77 生生命命奥奥秘秘 wwwwww..lliiffeeoommiiccss..ccoomm 在上述技术中，对于前三种技术的研究最为深入，应用范围也最为广泛。 1.2 质谱分析的方法主要有下列几种： 1.2 .1 蛋白质样品的准备[17,18] 样品制备是双向电泳中最为关键的一步，这一步的操作将直接影响2-DE的结果。但是，目前并没有形成 一个通用的制备方法。尽管处理方法多种多样，但都遵循下面几个基本原则： 尽可能提高样品蛋白的溶解度，抽提最大量的总蛋白，减少蛋白质的损失； 减少对蛋白质的人为修饰； 破坏蛋白质与其它生物大分子之间的相互作用，并使蛋白质处于完全变性状态。 根据以上原则，样品制备需要四种主要试剂： 变性剂，主要包括尿素和硫脲； 表面活性剂，常使用NP-40 、TritonX - 100 、CHAPS与Zwittergent系列等双性离子去垢剂； 还原剂，最常用的是二硫苏糖醇，其它可供选用的还原剂还有二硫赤藓糖醇、磷酸三丁酯等。 此外，也可以选择性地加入三羟甲基氨基甲烷、蛋白酶抑制剂如EDTA 、PMS F或蛋白酶抑制剂 cocktails 以及核酸酶等。 88 样品的来源不同，所使用的裂解缓冲液也不尽相同。通过不同试剂的合理组合，以达到对样品蛋白的最 大抽提率。在对样品蛋白质提取的过程中，必须考虑到去除影响蛋白质可溶性和2-DE 重复性的物质，比如核 酸、脂、多糖等大分子以及盐类小分子。大分子的存在会阻塞凝胶孔径，盐浓度过高则会降低等电聚焦的电 压，甚至会损坏IPG胶条，这些都会造成2-DE的失败。而样品制备的失败是很难通过后续工作的完善或改进 来弥补的。 核酸的去除可采用超声或核酸酶处理，超声处理应控制好条件，并防止泡沫产生；而加入的外源核酸酶 则会出现在最终的2-DE胶上。脂类和多糖都可以通过超速离心除去。降低盐浓度可以采用透析，但需时过 长；此外，也可以采取凝胶过滤或沉淀/重悬法脱盐，但该方法会造成蛋白质的部分损失。因此，处理方法必 须根据不同的样品、所处的状态以及实验的目的和要求进行选择，以获得最佳的实验结果。 1.2 .2 蛋白质双向电泳 双向电泳 （2- DE ）是蛋白质组学研究的三大 分离可以达到极高的分辨率和灵敏度，该技术甚至 核心技术之一。2- DE在蛋白质组学研究中处于非 能分离细胞中多达5000种的蛋白。 常重要的位置，它可用于蛋白质转录及转录后的修 2- DE在分离蛋白质混合样品、比较差异方面 饰研究、蛋白质组的比较和蛋白质间的相互作用、