动物细胞培养的方法.pptVIP

细胞冷冻保存技 细胞的低温保存 细胞低温冷冻贮存是细胞培养的常规工作。细胞冻存与细胞传代保存相比可以减少人力、经费，减少污染，减少细胞遗传性状的改变和延缓衰老。 目前，动物细胞一般保存于液氮中 （-196℃）。 一般在原代或传代2－10次内即大量冻存，作为原种（stock cells），取一支细胞进行传代繁殖，用毕再冻存，这样可保证长期使用和延缓衰老 。 如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶，从而减少细胞内冰晶对细胞的损伤；相反，结晶很大，大结晶会造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂。 在培养液中添加的保护剂： 二甲亚砜（Dimeethylsulfoide,DMSO）， 甘油,可使细胞免受低温冰晶形成、及渗透压改变而导致的物理损伤。 预先配制冻存保护液： 含20%血清培养基，10%DMSO，DMSO液用培养液配好，避免因临时配制产热而伤害细胞； 冻存和复苏的原则：慢冻快融 　　当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。 　　如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反，结晶很大，大结晶会造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。 冻存培养细胞 (1)预保留细胞经消化分散后，用将其预冷却，4度 取对数生长期细胞，经胰酶消化后，加入适量冻存液,用吸管吹打制成细胞悬液（1- 5 ×106细胞/ml)； 冷冻保护剂降温时减少细胞内冰晶分子的形成，以免对细胞造成伤害。 (2)加入1ml细胞悬液于冻存管中，在火焰下将安瓿封口。密封后标记冷冻细胞名称和冷冻日期。 可用带有18G针头注射器进行分装，如剂量过大，保护剂对细胞渗透作用不匀，冷冻效果不好。 (3)加保护剂的细胞悬液经缓慢冷冻，结冰产生在细胞外(对细胞没有损伤)。如果要长期保存，可以使用液氮罐， (4)冻结好的安瓿放入低温冰柜或液氮罐中。温度达-150~-190 ℃ ，细胞几乎处在停止状态。 冷冻时带手套操作，以免冻伤。 慢冻程序 标准程序： 当温度在-25℃以上时， 1～2℃/min 当温度达-25℃以下时， 5～10℃/min 当温度达-100℃时，可迅速放入液氮中 将冷冻管（管口要朝上）放入纱布袋内，纱布袋系以线绳，通过线绳将纱布袋固定于液氮罐罐口，按每分钟温度下降1～2℃的速 度，在40分钟内降至液氮表面，停30分钟后，直接投人液氮中。 悬浮细胞复苏方法 　 （1）从液氮中取出冷冻管，迅速投入37～38 ℃水浴中，使其融化（1分钟左右）； 　 （2）5分钟内用培养液稀释至原体积的10倍以上； 　　（3）低速离心10分钟； 　　（4）去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。 　贴壁细胞的复　　 　冻存细胞的复苏以急速溶化为原则， 　使培养物能快速通过对细胞有损害的 -50～0摄氏度区域。 步骤　　　 从液氮取出冻存细胞，立即投入盛有38摄氏度温水的容器内，摇动冻存管，使其内容物在20-60秒内完全溶化成悬液。无菌下打开冻存管，接种于培养瓶中,加入新鲜培养液，37摄氏度孵箱培养24小时更换培养液去除冻存液，继续培养。 常用术语及解释 细胞培养(cell culture）：即细胞（包括单个细胞）在体外条件下的生长。在细胞培养中，细胞不再形成组织。 细胞杂交（cell hybridization）：两个或多个不同的细胞融合。导致一个含核体(aynkaryo）的形成。 体外培养转化（in vitro transformation）：细胞在体外培养中发生与原细胞遗传性状不同的变化，但不一定具有致癌性。 单倍体（haploid）：正常细胞染色体基本数（每一染色体只有一种）。 整倍体（euploid）：具有两个以上单倍体数目的细胞。 非整倍体（aneuploid）：细胞核内染色体数为单倍染色体数的非整倍数时称非整倍体。 二倍体（diploid）：具有两套染色单体数目的细胞（2n）. *原代培养（primary culture）：从体内取出细胞或组织的第一次培养。 *传代培养（subculture）：也称再培养无论是否稀释，将细胞从一个培养瓶转移或移植到另一个培养瓶即称为传代或传代培养。也称再培养。 单层培养（monolayer culture）：培养细胞在底物上长成单层。 悬浮培养（suspension culture）：细胞在培养液中是悬浮状态生长。 *贴壁依赖性（anchorage-dependent）：为细胞需贴附于底物或支持物上才能生长的性质。 贴壁依赖性细胞(anchorage- dependent