实验一细胞形态结构的显微镜观察.pptVIP

实验三 叶绿体的分离与荧光观察 指导教师：唐颖 1.实验目的 通过植物细胞叶绿体的分离, 了解细胞器分离的一般原理和方法。 观察叶绿体的自发荧光和次生荧光, 并熟悉荧光显微镜的使用方法。 2.实验原理 2.1 差速离心 2.2 荧光显微镜的使用原理 荧光显微镜是免疫荧光细胞化学的基本工具。它是由光源、滤板系统和光学系统等主要部件组成。 某些物质在一定短波长的光（如紫外光）的照射下吸收光能进入激发态，从激发态回到基态时，就能在极短的时间内放射出比照射光波长更长的光（如可见光），这种光就称为荧光。 有些生物体内的物质受激发光照射后，可直接发出荧光，称为自发荧光，如叶绿素的火红色荧光。 有的生物材料本身不发荧光，但它吸收荧光染料后同样也能发出荧光，称为间接荧光，如叶绿体吸附吖啶橙后可发橘红色荧光。 使用方法 ①打开灯源，超高压汞灯要预热几分钟才能达到最亮点。 ②透射式荧光显微镜需在灯源与聚光器之间装上所要求的激发滤片，在物镜的后面装上相应的阻断滤片。落射式荧光显微镜需在光路的插槽中插入所要求的激发滤片／双色束分离器／阻断滤片的插块。 ③用低倍镜观察，根据不同型号荧光显微镜的调节装置，调整光源中心，使其位于整个照明光斑的中央。 ④放置标本片，调焦后即可观察。 使用中应注意：末装滤光片不要用眼直接观察，以免引起眼的损伤；用油镜观察标本时，必须用无荧光的特殊油镜；高压汞灯关闭后不能立即重新打开，需经5分钟后才能再启动，否则会不稳定，影响汞灯寿命。 3.实验材料、用品 器材 离心机、研钵或组织捣碎机、显微镜、天平、离心管、纱布、烧杯、量筒、滴管、载玻片、盖玻片。 材料 新鲜菠菜叶。 试剂 0.35mol/L氯化钠溶液 。 4.实验步骤 叶绿体的分离与观察 取新嫩菠菜叶，洗净檫干、去梗，称30g，分批放入研钵。 加入0.35mol/L氯化钠溶液， 共150ml，研磨，制成匀浆； 将匀浆用6层纱布过滤于烧杯中； 取滤液4ml在1000r/min下离心2min，取上清； 上清液3000r/min，离心5min．去上清，沉淀即为叶绿体； 加0.35mol/L氯化钠溶液悬浮沉淀； 取叶绿体悬液1滴于载玻片上，加盖片，观察。 菠菜叶徒手切片观察 新嫩菠菜叶斜切面1片，0.35mol/L氯化钠溶液1滴；加盖片轻压：观察。 叶绿体的分离与观察 (1)在普通光镜下观察。 (2)在荧光显微镜下观察叶绿体的直接荧光。 (3)在荧光显微镜下观察叶绿体的间接荧光: 取叶绿体悬液一滴滴在无荧光载片上,再滴加一滴0.01%吖啶橙荧光染料, 加盖片后即可在荧光显微镜下观察。 菠菜叶徒手切片观察 (1)在普通光镜下观察。光镜下观察叶绿体在表皮细 胞和保卫细胞中的分布； (2)在荧光显微镜下观察叶绿体的直接荧光。 (3)在荧光显微镜下观察叶绿体的间接荧光: 取叶绿 体悬液一滴滴在无荧光载片上,再滴加一滴0.01% 吖啶橙荧光染料, 加盖片后即可在荧光显微镜下 观察。 5.实验结果 一 叶绿体的分离和观察 普通光镜下,可看到叶绿体为绿色橄榄形, 在高倍镜下可看到叶绿体内部含有较深的绿色小颗粒,即基粒。 以Olympus荧光显微镜为例,在先用B(bule)激发滤片, B双色镜和O530(orange)阴断滤片的条件下, 叶绿体发出火红色荧光。 加入吖啶橙染色后, 叶绿体可发出桔红色荧光, 而其中混有的细胞核则发绿色荧光。 菠菜叶手切片观察 在普通光镜下可以看到三种细胞 (1)表皮细胞：为边缘呈锯齿形的鳞片状细胞; (2)保卫细胞：为构成气孔的成对存在的肾形细胞; (3)叶肉细胞：为排列成栅状的长形和椭圆形细胞.叶绿体呈绿色橄榄形,在高倍镜下还可以看到绿色的基粒。 在荧光显微镜下, 叶绿体发出火红色荧光,但其荧光强度要比游离叶绿体弱, 气孔发绿色荧光, 两保卫细胞内的火红色叶绿体则环绕气孔排列成一圈。表皮细胞内的叶绿体数量要比叶肉细胞少。 用吖啶橙染色后, 叶绿体则发出桔红色荧光, 细胞核可发出绿色荧光, 气孔仍为绿色。 6.注意事项 在荧光观察时应抓紧时间, 防止荧光淬灭。有必要时立即拍照。 在制作荧光显微标本时最好使用无荧光载片、盖片和无荧光油。 7. 思考题 分离叶绿体实验的原理是什么？操作过程中应注意什么？ 普通光学显微镜和荧光显微镜的原理有何异同点？ 生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室 大连理工大学 环境与生命学院 Differential centrifugation 具体见实验二 荧光显微镜的使用原理示意图 Olympus（日本） IX71 低速台式大容量离心机 TDL-5 下一张 光镜下叶肉细胞的叶绿体（ ×1000） 光镜下显示菠菜叶片保卫细胞 （× 1000） 光镜下