聚乙二醇修饰重组人肿瘤坏死因子α的合成和分离纯化.pdfVIP

第34 卷 分析化学 （FENXI HUAXUE ） 研究简报 第4 期 2006 年4 月 Chinese Journal of Analytical Chemistry 565 ～ 568 聚乙二醇修饰重组人肿瘤坏死因子-α 的合成和分离纯化 姜嫣嫣 洪鸣凰 裴元英# （复旦大学药学院药剂教研室，上海200032 ） 摘 要 分别以重组人肿瘤坏死因子-α（TNF-α ）和NHS-PEG-MAL 的摩尔比为1: 5 、1: 20 、1: 40 、1: 60 ，于不同 时间下进行PEG 化反应。反应混合物经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS）测定和Image Master 图象分 析系统定量凝胶中游离蛋白质，评价蛋白质PEG 化程度；采用灌注色谱技术，通过阳离子交换柱分离纯化反 SDS法可使游离TNF- 与PEG-TNF- 达到完全分离；TNF- 的PEG 化程度随 应混合物。结果显示： α α α PEG 量和反应时间的增加而提高。反应混合物被阳离子交换柱分离成PEG、PEG-TNF-α 混合物和游离TNF-α 。 关键词 聚乙二醇，聚乙二醇化，重组人肿瘤坏死因子，电泳，灌注色谱法，纯化 1 引 言 ［1］ 国际上用聚乙二醇（PEG ）化学修饰生物活性蛋白质的研究已从先导性探索进入产品开发阶段 。 对被修饰蛋白的分离纯化方法、修饰度及结构的测定是该类产品开发的核心与难点。目前，PEG 化蛋 白质分离分析方法的报道主要有分光光度法、液相色谱法、电泳法及质谱法等［2 ～ 4 ］。其中一些存在操作 复杂、分析精度较低或谱带扩展较宽等缺点。本研究考察了PEG 与TNF-α 的不同摩尔比和反应时间对 形成PEG-TNF-α 结合物的影响。采用SDS法对反应产物进行分离和分子量测定；运用图像分析 系统可快速、准确地定量分析电泳图像；并首次采用灌注色谱技术快速纯化PEG 化反应混合物。本方 法有可能成为PEG 化蛋白质的有效方法。 2 实验部分 2 . 1 材料与仪器 NHS-PEG-MAL （N-hydroxylsuccimide-PEG-maleimide ，Mr = 3400 ，美 国 Nektar 公司）；TNF-α （Mr = 17000 ，第二军医大学神经生物教研室提供）；Mini-Protein III 型电泳仪（美国Bio-RAD 公司）； Image MasterTM VDS-CL 图像分析系统（瑞典Amersham Pharmacia Biotech ）；BioCAD 700E 灌注色谱仪和 POROS 20HS 色谱柱填料（美国Applied Biosystems ）；GL-20G- 高速冷冻离心机（上海安亭科学仪器厂）。 Ⅱ 2. 2 实验方法 2. 2. 1 含量测定 在PEG 化的TNF-α 中，TNF-α 的含量测定采用Bradford 法。此法PEG 对蛋白质的 ［4 ］ PEG 的含量测定采用Barker 法 ，此法蛋白质对PEG 的测定无干扰。 测定无干扰； 2. 2. 2 PEG 修饰TNF-α 和SDS分析 分别按TNF-α（0 . 4 g/ L ）与NHS-PEG-MAL 的摩尔比为 1:5 、1: 20 、1: 40 和 1: 60 ，于HEPES （10 mmol/ L ，pH 8. 0 ）缓冲液中，在4 ℃ 下，进行共价结