从孕妇外周血分选胎儿细胞行无创性产前诊断的研究.docVIP

前 言 一、本研究的现实意义 在过去的半个多世纪中，伴随着人口和疾病模式的转变，出生缺陷问题日益突出，已成为我国婴儿死亡、儿童和成人残疾的主要原因之一。根据1986年至1987年卫生部组织的全国出生缺陷监测资料，全国出生缺陷的总发生率为13.01‰。但我国出生缺陷监测结果所显示的数据，并不能反映我国出生缺陷的真实发生水平,监测所得到的出生缺陷发生率仅仅是冰山之顶，明显偏低。国外研究表明，在发展中国家，严重遗传性疾病和出生缺陷到5岁时的累积发生率可达到78.6‰，但在出生时仅仅能发现其中的27.6‰。鉴于我国出生缺陷监测对象偏重于城市地区、诊断水平还不高等原因，我国专家根据现有的国内外资料判断我国出生缺陷的发生率应在40‰～50‰以上，我国每年实际发生的出生缺陷至少有80万～100万例，即每30秒～40秒钟就有一个出生缺陷儿降生。所以，从2000年起，我国决定在全国范围开展出生缺陷干预工程。 出生缺陷干预的关键是预防，世界卫生组织提出的预防出生缺陷的“三级预防”策略是： 一级预防是防止出生缺陷儿的发生，包括婚前检查、遗传咨询、选择最佳的生育年龄、孕早期保健，包括合理营养、预防感染、谨慎用药、戒烟戒酒、避免接触放射线和有毒有害物质、避免接触高温环境等；二级预防是减少出生缺陷儿的出生，主要是在孕期通过早发现、早诊断和早采取措施，以预防出生缺陷儿的出生；三级预防是对出生缺陷的治疗。由于大部分出生缺陷还缺乏特异的一级预防措施，目前出生缺陷干预在很大程度上依赖于产前筛查和产前诊断。 产前诊断是近代医学科学的一项重大进展，它通过对胚胎或胎儿是否患有某种遗传病或先天缺陷在出生前作出准确判断，指导进行选择性流产，以防止病残儿出生，从而使生育健康后代的理想成为现实。在过去的几十年中，产前诊断的方法主要是靠绒毛活检 （chorionic villus sampling，CVS）、羊膜腔穿刺和脐静脉穿刺等有创伤性的检查，且主要是应用在怀疑孕育有染色体病胎儿的孕妇和高龄孕妇中。但作为一个群体，这些高危人群生出的唐氏综合症患儿的绝对数量只占20%左右，80%以上的患儿是35岁以下的低危孕妇所生【1】，而这些孕妇往往并没有做产前诊断，原因是这些有创性产前诊断方法可能导致0.5%～1%的胎儿流产或早产，另外还可能造成宫内感染、胎儿肢体损伤、孕妇焦虑症等不良后果，从而妨碍了产前诊断的普及。 目前在临床上常规应用的无创性产前诊断方法包括超声和孕妇血清筛查。但研究证实这两种方法均不十分理想。Ewigman及其同事【2】在1993年进行了一项多中心研究，15000名选用超声筛查的孕妇，只有35%的胎儿畸形被发现，且这其中只有一半（17%）的异常是在妊娠24周以前被发现的。尽管许多超声学标志如胎儿颈项透明层（nuchal fold thickening,NT）、心脏缺陷、股骨及鼻骨缩短等被证明与唐氏综合征有关，但用这些联合指标综合评价也只能诊断出40%～60%的唐氏综合征患儿【3】。在孕妇血清中含有由胎儿或胎盘产生的特异性蛋白如未结合雌三醇、甲胎蛋白及人绒毛膜促性腺激素，如果在孕早期检测孕妇血清中以上三种激素的含量，即所谓孕妇血清学三联筛查，用于35岁以上的高龄孕妇时，可以发现87%的唐氏综合征，但假阳性率高达23%～34%；如果用于筛查小于35岁的孕妇，则只有60%的唐氏综合征病例被筛出，假阳性率为5%【4】，所以这种筛查方法也是不理想的。因此探索一条可应用于所有孕妇的、常规筛查胎儿染色体异常的无创伤性产前诊断新途径近年来一直是当前国际医学遗传学和生殖医学界关注的焦点之一。本研究即是要探讨一种从孕妇外周血中分选出胎儿有核红细胞从而进行无创伤性产前诊断的方法，如果这种方法可行并能成功应用于临床，必将使未来的产前诊断更加简便、安全和普及，必将明显降低新生儿出生缺陷发生率，提高出生人口素质，具有极大的经济效益和社会效益。 二、孕妇外周血中胎儿细胞的发现及种类 早在1893年，Schmol就在死于子痫的孕妇肺循环中发现滋养层细胞，首先提出孕妇血中存在来自胎儿的细胞，该观点后来被其他研究者所证实【5】。尽管滋养层细胞早在妊娠6周就可以出现于孕妇血中，终止妊娠后即不复存在，其特殊的形态也便于在显微镜下辨认，但因其在正常妊娠中，会很快在肺循环中被清除，且其多核特征及嵌合性特点干扰遗传学分析，故滋养层细胞并没有作为胎儿细胞的分选对象而得到广泛应用。 1969年，Walknowska【6】等发现了母血中的胎儿淋巴细胞可以说是无创伤性产前诊断技术发展的一个里程碑。他们发现在孕有男性胎儿的母血中的淋巴细胞分裂原存在Y染色体。1979年，Herzenberg等【7】报道使用HLA-A2的单克隆抗体，用荧光激活的细胞分选法自孕妇外周血中分离出了淋巴细