高中生物《第五章 第二节 多聚酶链式反应扩增nda片段》课件2 新人教版选修1.pptVIP

温故知新1: 组成DNA分子的基本单位是什么? 这些基本单位是如何连接成DNA分子的? DNA分子结构有什么特点？ 1、 PCR（多聚酶链式反应）技术：是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，它能以极少量的DNA为模板，在几小时内复制出上百万份的DNA拷贝。 2、原理：利用了DNA的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合。 比色杯 四、 课题延伸 例如：PCR产物每轮循环增加一倍，30轮循环扩增量达230个拷贝（109拷贝） PCR技术是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。 它具有特异性强、敏感性高、产率高、 快速、 简便、重复性好、易自动化等突出特点。 * * 脱氧核苷酸 脱氧核苷 磷酸 脱氧核糖 含氮碱基 嘌呤 嘧啶 腺嘌呤（A） 鸟嘌呤（G） 胞嘧啶（C） 胸腺嘧啶（T） 1 2 3 4 5 碱基 OH O O P O HO OH O O P O HO 碱基 OH OH 1 5 2 4 3 O O P O HO 碱基 O OH O O P O HO OH 碱基 碱基 脱氧核糖 磷酸基团 碱基 脱氧核糖 碱基 脱氧核糖 5’ 3’ 脱氧核苷酸链结构简图 磷酸二酯键 5’ 5’ 3’ 3’ DNA分子的复制过程是怎样的？ DNA分子的复制需要哪些条件？ 温故知新2 DNA母链：提供复制的模板 解旋酶：打开DNA双链 4种脱氧核苷酸：合成子链的原料 DNA聚合酶：催化合成DNA子链 ATP：为复制过程提供能量 引物：使DNA聚合酶从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸(一小段RNA) DNA复制的条件 一、基础知识（一）PCR原理： DNA母链：提供复制的模板 解旋酶： 打开DNA双链 4种脱氧核苷酸：合成子链的原料 DNA聚合酶： 催化合成DNA子链 ATP：为复制过程提供能量 引物：使DNA聚合酶从引物的3′端开始连 接脱氧核苷酸(一小段RNA) 3、PCR反应的条件 80—100℃： 耐热的DNA聚合酶： 缓冲溶液：维持反应的pH值不变 (一般是一小段单链DNA) (二)PCR反应的过程 1、变性： 温度上升到90℃以上时,双链DNA解聚成为单链。 2、复性（退火）： 温度下降到50℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合。 3、延伸： 温度上升到72℃左右,溶液中的4种脱氧核苷酸在Taq DNA聚合酶的作用下,根据碱基互补配对的原则合成新的DNA链。 PCR 循环第一步 ：加热变性: 双链DNA解聚成为单链 靶序列 靶序列 引物 Ⅰ 引物 Ⅱ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ PCR 循环第二步 ：引物与靶序列复性（退火）: 引物与模板DNA单链的互补序列配对结合 靶序列 靶序列 引物Ⅰ 引物Ⅱ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ Taq DNA 聚合酶 PCR 循环第三步 ：引物延伸: 合成新的DNA链 靶序列 靶序列 第1个 PCR 循环完成后 ：得到两个拷贝的靶序列 1,048,576 20 1,073,741,824 30 8 3 4 2 2 1 DNA数量 循环次数 30次循环后靶序列扩增的数量 4、PCR 循环的结果 ② DNA聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序列呈指数扩增。 ①从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链会与引物Ⅱ结合，进行DNA的延伸。 二、 实验操作 1、PCR仪 （一）设备及用具 实质上一台能够自动调控温度的仪器。 2、微量离心管 一种薄壁塑料管，总容积为0.5ml。 3、微量移液器 用于定量转移PCR配方中的液体，其上的一次性吸液枪头用一次更换一次。 PCR仪 微量离心管 微量移液器 1、准备 2、移液 （二）实验操作步骤 按照PCR反应体系的配方将所需用的试剂摆放在实验桌上 用微量移液器按照PCR反应体系配方往微量离心管里面加入各种试剂 ①过程：盖严微量离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁。 ②注意： 3、混合 B、手指轻轻弹击微量离心管的管壁，目的是使反应液混合均匀。 A、离心管口的盖子一定盖严，防止实验中脱落或液体外溢。 将离心管放入PCR仪上，设置好PCR仪的循环程序。 ①过程：将微量离心管放在离心机上,离心约10s。 4、离心 5、反应 ②离心目的：使反应液体集中在离心管底部，提高反应效果。 72℃，1min 55℃，30s 94℃，1min 最后一次 72℃，1min 55℃，30s 94℃，30s 30次 － － 94℃，5min 预变性 延伸 复性 变性 循环数 PCR技术高度灵敏，为了避免外源DNA等因素的污染而造成干扰实验，PCR操作时要注意做到： 6、注意事项 ①隔离操作区，所用微量离心管、枪头