酵母蔗糖酶的分离纯化论文.docVIP

酵母蔗糖酶的分离纯化 （ 浙江工业大学 药学院 药学1002+工商管理 浙江 杭州310014） 摘要： 本实验采取菌体自溶的方法来破碎细胞壁后经菌体分离提取蔗糖酶液，再在适宜条件下进行热提取，醇提取的方法进行初步提纯。然后采用例子交换柱的对初提取液进行纯化，讨论该方法相较于其他的有哪些优缺点，及实验中的重要步骤。用DNS方法对每步提取后的溶液进行酶活力测定，对比其活力大小。然后利用凯式定氮发及Folin-酚法对每步提取液的蛋白质量，比活力进行测定，对比两种方法各有哪些方面的优势及劣势，并确定最简单有效地蛋白质测定方法。掌握蛋白质标准曲线制定的关键方法。最后，采用SDS凝胶电泳测定蛋白质的分子量。并与其他测点蛋白质分子量测定法分析比较，分析利弊，并提出改进的方法。结合以上每步实验，总结实验过程中提取纯化时的关键步骤及相关问题讨论。实验确定蔗糖酶的最适PH值等于5，最适温度为35度，（待修改） 关键词：蔗糖酶 提取纯化 酶活力 蛋白质含量 1.文献综述 蔗糖酶蔗糖酶(Sucrose，EC 3．2，l_26) 又称转化酶(Invertase)。1828年Dumas等首先指出酵母菌发酵蔗糖时必须有这种酶的存在。蔗糖在蔗糖酶的作用下，水解为葡萄糖和果糖，所以甜度增加。按水解蔗糖的方式，切开蔗糖的B—D一呋哺果还原力增加，又由于生成蔗糖酶可分为从果糖末端EC 3 2．1，2o3 和从葡萄糖末端切开蔗糖的 —D一葡萄糖。苷酶( — uc呻 d丑se EC 3．2．1，20)。前者存在于酵母中，后者存在于霉菌中,工业上多从酵母中提取 。 蔗糖酶的提取及性质研究经过提取，提纯，酶活力测定，比活力，蛋白质含量及相对分子量测定，不同的实验方法对结果又较大的影响。 1 蔗糖酶的提取 现阶段主要存在甲苯自溶法、冻融法、SDS抽提法三种方法。不同的提取方法的提纯环境的要求不同，且提纯效果有一定的差异。不同提取方法的比较如下： 表1 不同蔗糖酶提取方法比较 蔗糖酶提取方法 提取液酶活性 实验优点 实验缺陷 甲苯自溶法 偏低 试剂简单、价格低廉 其耗时长、重复性差、酶活性低 一般，是甲苯自溶的534倍。 可以确定提取蔗糖酶的最佳条件 耗时长，操作繁杂。 SDS抽提法 最好，是甲苯自溶的1120倍。 操作简便易行、生产成本低、回收率高 从表中可看出,SDS 抽提法的酶活性最高, 冻融法次之, 常规的甲苯自溶法酶活性最低。所以，一般情况下，为保证酶的产率和活性会选择SDS法进行蔗糖酶的提取，且由于操作简单，更适合于酵母蔗糖酶大规模的制备提取[1]但实验室为保证低成本，有时也会采用甲苯自溶法。 1.2蔗糖酶的提纯 1.2.1 常见的蛋白质的纯化方法 不同形式的纯化方法：（1）根据分子大小不同的分离方法：透析和超过滤子不能通过半透，密度梯度离心；凝胶过滤。（2）利用溶解度差别分离：等电点沉淀法。盐溶与盐析（3）根据电荷不同的分离方法，主要包括电泳和离子交换层析分离。（4） 蛋白质的选择吸附分离（5）根据配体特性的分离——亲和层析（6)　低温有机溶剂沉淀法: 用与水可混溶的有机溶剂，甲醇，乙醇或丙酮，可使多数蛋白质溶解度降低并析出。 1.2.2 主要方法简介与比较 现在常用的分离方法又：（1）离子交换柱法：以离子交换剂作为柱填充物，在中性条件下，根据由于蛋白质和多肽的带电性不同而引起的离子交换亲和力的不同而得到分离。该方法是目前最常用的方法，就有很高的纯化效果，曾成功地从盐源山蛭(Haemendipsa yunlyuanensis)头部分离纯化了抗凝血多肽[2].。（2）电泳法：酶蛋白质混合样品经过电泳后，被分离的各蛋白质组分的电泳迁移率互不相同，由各蛋白质组分所带的静电荷以及分子大小和形状的不同而达到分离活力的测定。且在得出双向凝胶电泳的效果在电泳方法中最好[3].。（3）蛋白质盐析：当盐浓度不断上升时，蛋白质的溶解度又以不同程度下降并先后析出，此称盐析，从而达到分离纯化的效果。一般粗提物中常用此方法。（4）有机溶剂沉淀：有机溶剂能降低溶液的介电常数，从而增加蛋白质分子上不同电荷的引力，导致溶解度的降低；另有机溶剂与水的作用，能破坏蛋白质的水化膜，故蛋白质在一定浓度的有机溶剂中便沉淀析出。该方法经常用于酶的提纯[4] 。（5）等电点法：利用蛋白质在等电点时溶解度最低而各种蛋白质具有不同的等电点的特点进行分离的方法。用于提取后去除杂蛋白，通过变动提取液的pH使某些与待提纯的蛋白质等电点相距较大的杂蛋白从溶液中沉出。但此法很少单独使用，可与盐析法结合使[5] 。 目前，除上述技术外，如移动界面电泳，各种形式