常用细胞凋亡检测方法（三）三、线粒体膜势能的检测.pdfVIP

中国试剂网 3.8.4.10 常用细胞凋亡检测方法 （三） 三、线粒体膜势能的检测 线粒体在细胞凋亡的过程中起着枢纽作用，多种细胞凋亡刺激因子均可诱导 不同的细胞发生凋亡，而线粒体跨膜电位DYmt 的下降，被认为是细胞凋亡级联 反应过程中最早发生的事件，它发生在细胞核凋亡特征 （染色质浓缩、DNA 断 裂）出现之前，一旦线粒体DYmt 崩溃，则细胞凋亡不可逆转。 线粒体跨膜电位的存在，使一些亲脂性阳离子荧光染料如Rhodamine123 、 3，3Dihexyloxacarbocyanineiodide[DiOC6 （3 ）]、Tetrechlorotetraethylbenzimidazol carbocyanineiodide[JC1]、Tetramethylrhodaminemethylester(TMRM)等可结合到 线粒体基质，其荧光的增强或减弱说明线粒体内膜电负性的增高或降低。 方法：将正常培养的细胞和诱导凋亡的细胞加入使用终浓度为 Rhodamine 123 （1mM）或终浓度为DiOC6 （25nM ），JC1 （1mM），TMRM （100nM），37° 平衡 30min，流式细胞计检测细胞的荧光强度。 注意事项 1． 始终保持平衡染液中 pH 值的一致性，因为pH 值的变化将影响膜电位。 2 ． 与染料达到平衡的细胞悬液中如果含有蛋白，他们将与部分染料结合， 降低染料的浓度，引起假去极化。 四、DNA 片断化检测 细胞凋亡时主要的生化特征是其染色质发生浓缩, 染色质 DNA 在核小体单 位之间的连接处断裂, 形成 50~300kbp 长的 DNA 大片段, 或 180~200bp 整数倍 的寡核苷酸片段, 在凝胶电泳上表现为梯形电泳图谱(DNA ladder) 。细胞经处理 后，采用常规方法分离提纯 DNA ，进行琼脂糖凝胶和溴化乙啶染色，在凋亡细 胞群中可观察到典型的 DNAladder 。如果细胞量很少，还可在分离提纯DNA 后， 用 32PATP 和脱氧核糖核苷酸末端转移酶 （TdT ）使DNA 标记，然后进行电泳 和放射自显影，观察凋亡细胞中DNAladder 的形成。 1. 大分子染色体 DNA 片段的测定 细胞凋亡的早期,染色体断裂成为 50~300kbp 长的 DNA 大片段。所有超过一定分 子量大小的双链 DNA 分子在琼脂糖凝胶中的迁移速度相同。线性 DNA 的双螺 旋半径超过凝胶半径时，即达到分辨力的极限。此时凝胶不再按分子量的大小来 中国试剂网 3.8.4.10 筛分 DNA ，DNA 像通过弯管一样，以其一端指向电场一极而通过凝胶，这种迁 移模式称之为爬行。因此，细胞凋亡早期产生的 50~300kbp 长的 DNA 大片段 不能用普通的琼脂糖凝胶电泳来分离。通常采用脉冲电泳技术可圆满地解决这一 问题。这个方法是在凝胶上外加正交的交变脉冲电场。每当电场方向改变后，大 的DNA 分子便滞流在爬行管中，直至新的电场轴向重新定向后，才能继续向前 移动。DNA 分子量越大，这种重排所需要的时间就越长。当DNA 分子变换方向 的时间小于电脉冲周期时，DNA 就可以按其分子量大小分开。 参 考 文 献 Brown,D.G., Sun, X.M., and Cohen, G.M.(1993) DexamethasoneinducedapoptosisinvolvescleavageofDNAtolargefragmentsprior tointernucleosomalfragmentation.J.Biol.Chem.268 2 ． DNALadder 测定 方法：收获细胞（1′107）沉淀?细胞裂解液?13000rpm′5min, 收集上清?1%SDS 和 RnaseA （5mg/ml ）56° ， 2h?蛋白酶 K （2.5mg/ml ）37° ，2h?1/10 体积 3M 醋酸钠和 2.5 倍体积的冷无水