电镜细胞样品制备方法的改进-电镜细胞样品制备方.pdfVIP

维普资讯 电子显微学报 J．Chin．Electr．Microsc．Soc 22(6)：671～672 2003年 67l 扫描电镜细胞样品制备方法的改进 ， 黄晓红，张奇亚 (中国科学院水生生物研究所，淡水生态与生物技术国家重点实验室，湖北 武汉 430072) 扫描电镜已广泛用于对细胞表面结构的观察， 胞超快扫描 电镜样 品制备中，还有另一种方案。在 但在细胞样 品制备过程 中，往往因脱水或干燥引起 制备高等植物的扫描电镜样品时，建立了全程序微 细胞体积或表面结构的改变，导致观察结果出现误 波辐射法，其方法与上述方法不同之处在于植物样 差或失真。为了避免这类问题，我们以鱼类培养细 品的干燥也是借助微波，利用微波炉解冻档，起始温 胞为材料，对其扫描电镜样品制备技术进行了一些 度为60℃，终止温度70±3oC，干燥 3～4min。 改进 ，举例如下。 2 单固定氯化金染色法 1 单固定半程序微波辐射法 对生物样品而言，氯化金有 良好的导电性，但没 微波辐射可应用于扫描电镜细胞样品的制备。 有固定作用，使其在扫描 电镜样品制备中的应用受 经微波辐射处理浸泡过的小 鼠肝、肾组织及植物样 到限制。但利用氯化金代替锇酸，制备扫描电镜和 品等，表明低温间歇微波辐射不会使样品产生严重 透射电镜样品，观察结果显示其图像质量符合要求。 损伤。实验结果显示，微波辐射不仅可以缩短制样 用氯化金替代锇酸，对贴壁培养的细胞进行制样，其 时间，还可以减少对细胞样品表面结构的损伤。为 具体步骤为：①固定：2．5％戊二醛固定2h。②前漂 了寻找更适用于鱼类培养细胞处理的方法，在已有 洗：0，Imol／L磷酸缓冲液漂洗二次，每次 lOmin。③ 工作的基础上，我们作 了些改进 ，如未用锇酸固定， 后漂洗 ：双蒸水漂洗 3次，每次 lOmin。④浸渍染色： 降低了制样成本；同时进一步缩短辐射时间，将整个 2％氯化金两次，每次 1．5h。⑤前漂洗 ：0．Imol／L磷 制样过程从约 9h缩短为约 2h，尽量避免或减少细 酸缓冲液漂洗 2次，每次 10min。⑥后漂洗 ：双蒸水 胞样品受损。 漂洗3次，每次 lOmin。⑦脱水：乙醇逐级脱水，依次 处理鱼类培养细胞 的过程是先将一直径为 为 50％，70％，90％，100％，100％，每次 lOmin。⑧置 15cm、内盛 200ml水 的培养皿置于微波炉 (型号 换：纯乙酸异戊酯置换20min或过夜。⑨干燥：CO MICROWAVEOVEN．b3OD，工作频率 2450MHz)内， 临界点干燥。 先用低档微波辐射 8min预热，用温度计测水温，起 注 ：配制 2％的氯化金时，用双蒸水配制为宜， 始温度约为20~C，使终止温度为30±5oC。如果温 不宜使用缓冲液。 度超过 35oC，则加冷水降温。随后将装有样品和浸 3 单 固定快速脱水法 泡液的小瓶放于培养皿 内，再继续用微波处理 一 般认为在制备易损样品 (菌类和纤毛)时，可 2min，并使样品保持在 35℃环境中。除干燥外，固 采用戊二醛单固定，但要根据不同的情况，选择脱水 定、脱水、置换均在炉内进行。具体步骤为：①前固 时间。常规方法是戊二醛和锇酸双固定后，起始用 定：在装有样 品的小瓶 中加入适量的2．5％的戊二 50％乙醇脱水，脱水时间为 10min。考虑到 70％的 醛，一般为样品的 l0倍。微波辐射 5min，炉外原液 乙醇通常用来暂存样品，因此选择 70％的乙醇为起 停留30min。②漂洗：每次微波