单分子测序技术在靶基因组测序及表观遗传学的应用第三代测序.pdfVIP

Gene Express 基因快讯2011年第2期 单分子测序技术在靶基因组测序及表观遗传学的应用 第三代测序技术 DNA测序技术的变革 对未知基因组测序。 以单分子测序系统PacBio RS为代表的第三代测序技 DN A 测序技术，不仅为基因组计划揭开了基因密 术，是一种模拟天然DNA复制过程的测序技术，不仅融合 码的神秘面纱，同时在诸如肿瘤及遗传性疾病治疗的医 了天然DNA复制高效准确的特点，而且是世界上唯一可以 药行业、材料科学行业、石油替代物研发的生物燃料行 在不影响聚合酶活性的前提下实时观察DNA合成的测序技 业、产能更高的种植业和畜牧业等领域都有着重要的应 术。由于聚合酶的平均反应速度可达1个碱基每秒以上， 用价值。 测序技术最早可以追溯到20世纪50年代，即1954年 因而其测序速度比Sanger测序快了几万倍。参与三代测序 技术研发的Korlach与Turner ，于2009年2月在 《Science》 出现的关于Whitfeld发明化学降解测序法的早期测序技术 杂志上发表了一篇介绍PacBio单分子DNA测序技术的文 报导。但从严格意义上讲，直到1977年Sanger等的双脱氧 章，代表了首个第三代测序技术的 “原理验证”[2] 。其 核苷酸末端终止法和Gilbert等的化学降解法的诞生，才标 后，他们又利用SMRT技术，直接测定了DNA 的甲基化， 志着第一代测序技术的确立。尽管在完成从噬菌体基因 这一发表在20 11年5月 《Nature Methods》上的研究成果， 组到人类基因组草图绘制等大量测序工作中，第一代测 相对于目前流行的第二代测序技术显然又前进了一大步 序技术充分展示了可靠、准确等优点，但其对于电泳分 [3] 。PacBio RS单分子测序系统目前的读长超过1kb ，比第 离技术的依赖及成本高、耗时长等局限性也日益显现， 二代测序要长得多，且不需要常规的PCR扩增过程，错 试想绘制一张人类基因组图谱需耗费数年时间显然无法 误率也大大降低，聚合酶动力学的直接观察赋予了PacBio 满足临床科研的紧迫需要。 RS系统在测序之外的更多应用 （表1）。 进入2 1世纪，诞生的第二代测序技术 （N GS, n ext generation sequencing ），不仅保持了第一代测序的高准 第一代测序技术 第二代测序技术 第三代测序技术 确度，而且大大降低了测序成本并极大地提高了测序速 技术类别 直接测序 深度测序 单分子实时测序 无需克隆，片段化 度