反向斑点杂交法快速检测HBV基因型反应条件的优化和建立.pdfVIP

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００９，２９（１２）：８５～８９ 反向斑点杂交法快速检测ＨＢＶ基因型 反应条件的优化和建立 赵　丽　张文露　胡　源　刘彦辰　赖国旗　杨　凤　黄爱龙 （重庆医科大学感染性疾病分子生物学教育部重点实验室　重庆　４０００１６） 摘要　利用反向斑点杂交技术，设计出特异性基因分型探针，并将探针固定在带正电荷的尼龙膜 上，与ＰＣＲ扩增带有地高辛标记的临床血清样本进行杂交。通过优化杂交反应条件，建立起简 单、快速、特异地检测ＨＢＶ基因型的方法。利用该方法对重庆地区临床样本进行分型检测，并与 ３ 直接测序结果比较。结果表明新建的ＨＢＶ基因分型方法可对拷贝数在１０以上的血清样本准确 分型，特异性达到９６．６７％。重庆地区感染ＨＢＶ主要以Ｂ型为主。 关键词　反向斑点杂交　ＨＢＶ　基因型　临床样本 中图分类号　Ｑ８１９ 　　乙型肝炎病毒（ｈｅｐａｔｉｔｉｓＢｖｉｒｕｓ，ＨＢＶ）感染呈世界 法、聚合酶链反应限制性片段长度多态性法、ＰＣＲ基因 范围广泛流行，ＨＢＶ感染不仅可导致急、慢性病毒性肝 分型法、单克隆抗体酶联免疫测定法和基因芯片法）， 炎，而且约 ２０％ ～３０％感染者因 ＨＢＶ相关疾 病死 但耗时费力，价格昂贵，本研究采用反向斑点杂交的方 ［１］ 亡 。根据ＨＢＶ核苷酸全序列异质性 ８％或Ｓ基因 法，无需特殊设备可达到快速检测 ＨＢＶ基因型，经济 ≥ 序列核苷酸差异度 ４％，将乙肝病毒株分为Ａ～Ｈ８ ≥ 简便，结果可靠。 ［２，３］ 种基因型 。不同基因型存在不同的地理分布特征， １　材料与方法 中国主要以Ｂ型和Ｃ型为主，其中北方以Ｃ型多见，南 ［４］ 方以Ｂ型多见 。另外在我国一些地区还存在少量的 １．１　 材　料 基因型Ａ和Ｄ。不同ＨＢＶ基因型在致病性和病毒学 １．１．１　试剂与仪器　大肠杆菌Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５ 由本室保 α 特性上存在明显差异。例如，基因型Ｄ和严重肝病、年 存。ＴａｑＤＮＡ聚合酶和ｐＭＤ１８Ｔ载体购自ＴａＫａＲａ公 ［５］ 轻人的肝细胞肝癌相关 。基因型Ｃ比基因型Ｂ更容 司。地高辛抗体碱性磷酸酶（ＨＲＰ）酶联底物 ＮＢＴ／ ［６，７］ 易导致严重肝病，后者对 干扰素应答率高 。因 α ＢＣＩＰＳｔｏｃｋｓｏｌｕｔｉｏｎ购自Ｒｏｃｈｅ公司。带正电荷的尼龙 此，确定慢性乙型肝炎患者体内病毒基因型对于疾病 膜购自ＧＥ公司。四乙基氯化铵（ＴＥＡＣＬ）购自Ｓｉｇｍａ 进展的风险预测、治疗方案的选择和患者的临床预后 公司。其余试剂为国产分析纯。 评估具有重要的临床意义。 　　ＰＣＲ仪购自Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ公司，ＤＮＡ电泳和凝胶成像 　　反向斑点杂交（ｒｅｖｅｒｓｅｄｏｔｂｌｏｔ，ＲＤＢ）技术将特异 仪购自ＢｉｏＲａｄ公司，ＨＬ２０００分子杂交仪为ＵＶＰ公司 性探针固化在支持物上，与ＰＣＲ扩增后带有标记的待 产品，恒温振荡培养箱为江苏太仓科教仪器厂生产。 ［８］ 测序列进行杂交，通过显色直接判断结果 。该方法 １．１．２　用于实验的ＨＢＶ基因组ＤＮＡ　Ｂ型、Ｃ型样本 具有快速、简便、敏感和特异的特点，广泛应用于基因 由重庆医