氨基酸的高效液相色谱探究.pdfVIP

文献综述 氨基酸的高效液相色谱分析 朱曙东 赵昇皓 徐（州医学院生物化学研究室 徐州 221002) 柱后衍生法的主要缺点有：(1)色谱仪器较复 1 前 言 杂，需要额外的泵和反应器以保证洗脱液与柱后试 氨基酸分析是生命科学研究中最重要的技术之 剂均匀混合。这样会使仪器局限于一类分析。2（）在 一 1958年，Spackman等[1,2]首先介绍了用离子交换 茚三酮方法中，单波长检测受流速、温度、缓冲液变 色谱与柱后茚三酮衍生结合的方法分析蛋白质水解 化的影响大而只在nmol以上方为可靠，常需双波长 生成的氨基酸，同时提出了构建氨基酸自动分析仪 检测，使仪器更加复杂、昂贵。(3)OPA法最大缺陷 的细节，建立了传统氨基酸自动分析技术。其后，传 是不能与亚氨基酸直接反应，而间接氧化步骤需要 统氨基酸分析随着衍生方法、柱载体化学、高效液相 在Pro被洗脱的瞬间变化柱后试剂，或用不同的试 色谱H（PLC）仪器学的迅猛发展，分析速度、灵敏度 剂分别反应一次。前者不易把握时间，不易校准Pro 和自动化程度不断提高[3]。近十年来，反相高效液相 与邻近氨基酸相对显色值；后者则进一步降低了原 色谱R（P-HPLC）与各种柱前衍生相结合的氨基酸 本相对其它氨基酸已低一个数量级的Pro检测灵敏 分析技术发展迅速，显示出各自特有的优越性，构成 度 。 了具有广泛适用性的现代氨基酸分析技术。本文拟 3 柱前衍生 就这一发展加 以综述，并系统阐述各种氨基酸 HPLC分析方法的优缺点，为研究工作和实际应用 从色谱分析 角度看，高效离子交换色谱 提供参考。 (HPIEC)氨基酸分析法没有充分发挥高压液相的优 大多数氨基酸无紫外吸收和荧光发射特性，标 势：易塑的离子交换珠比坚硬的无机材料压缩性大， 准折射探测仪对氨基酸检测也无足够的灵敏度。为 流动相流速的变化不与施加的压力成比例，无法充 提高分析检测灵敏度和分离选择特性，通常将氨基 分实现流动相的高速。另外，离子交换色谱的流动相 酸衍生。衍生方式有柱前衍生法与柱后衍生法。 也不适于具有高灵敏度的荧光检测。随着柱填料的 发展，RP-HPLC弥补了上述缺点，使氨基酸分析发 2 柱后衍生 生了根本的变化。其主要特点是：(1)采用可塑性小 传统的氨基酸分析技术用离子交换色谱分离氨 的硅胶等材料作载体，有利于流速的增加。2（）载体 基酸，柱后与茚三酮反应，三十余年来迭经改进灵敏 表面饰有C18、C8或其它疏水基团作固定相，能分辨 度已提高到200～500pmol，分析时间约减至1h[3]。 分子结构的细小差异，分辨率高。(3)反相色谱柱性 此法通常需要专门的仪器。 能稳定，流动相易平衡。(4)反相洗脱避免了离子交 用荧光胺F（luram）[]代替茚三酮能增加氨基酸 换色谱中流动相对荧光检测的干扰。因而与柱后衍 分析灵敏度P（ro等亚氨基酸除外），一般几个pmol 生离子交换法相比，RP-HPLC分析方法更加快速、 便可进行标准分析。邻苯二甲醛O（PA）比荧光胺更 灵敏。而且与局限于氨基酸分析的自动分析仪不同， 常用，但OPA不直接与Pro反应，需先将后者氧化 HPLC仪适用性极广。表1是两类氨基酸分析技术的 如（用次氯酸钠）开环后方可衍生[5]。OPA法检测极