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重组腺病毒载体的构建 心内科 李德 外源性基因的转移方法 磷酸钙－DNA共沉淀法 转染效率＜15% DEAE－葡聚糖法 转染效率25% 聚阳离子－DMSO法 显微注射技术 电穿孔法 脂质体载体法 病毒载体 病毒载体 SV40病毒载体 可整合到宿主染色体，可感染增殖和非增殖细胞 反转录病毒载体 整合到宿主染色体，只感染增殖细胞 腺病毒载体 不整合到宿主染色体，增殖和非增殖细胞均可感染 腺病毒载体的特点 主要以Ad5型病毒为框架构建 具有携带外源基因和转移外源基因的双重功能 可插入长达5kb的外源基因 通过受体介导的细胞内吞作用进行基因转移 安全性，复制缺陷（E1区缺陷） 腺病毒载体的特点 保留了E3区的腺病毒－－可逃逸宿主免疫应答，可用于体内基因治疗 不整合到宿主基因组 增殖和非增殖细胞均可感染 构建腺病毒载体的要素 腺病毒基因组质粒 穿梭质粒 目的基因片段 包装细胞 AdMax? system 穿梭质粒 pDC315 腺病毒载体的包装胞细 HEK293细胞－－E1区缺陷互补的细胞系 悬浮HEK293细胞，易大规模培养，可用于腺病毒大规模制备。但不易长期保持稳定。 单层培养HEK293细胞，稳定，用于重组腺病毒载体构建、蚀斑挑选。也可用于腺病毒扩增。 腺病毒载体的包装细胞 HEK293细胞的培养 高糖型DMEM 10%FBS（构建），10%NBS（扩增） HEK293细胞的传代次数与腺病毒载体构建和扩增 构建：＜20代－－构建成功的关键 扩增：无特殊要求 重组原理 重组腺病毒载体构建 以反义BTEB2腺病毒表达载体为例介绍重组腺病毒载体的构建过程 BTEB2简介 基本转录元件结合蛋白2－转录因子 功能：促进VSMC增殖和表型转化 外源性基因的制备 VSMC中提取总RNA RT－PCR得到BTEB2 cDNA 体会：从目的基因丰度高的组织或细胞中提取。 重组穿梭质粒的构建－－将PCR产物克隆到穿梭质粒 用BamH I 和 EcoR I 双酶切穿梭质粒pDC315及BTEB2 cDNA 用T4连接酶将BTEB2 cDNA反向连接到穿梭质粒 定向克隆 体会：设计引物时引入需要的酶切位点可使基因定向克隆的程序简化 重组穿梭质粒的鉴定 酶切鉴定：用BamH I 和 EcoR I 双酶切重组穿梭质粒pDC315ASBTET2，电泳 目的片段测序 重组腺病毒的制备 脂质体介导重组穿梭质粒和腺病毒基因组质粒共转染293细胞 实验步骤 1、转染液配制 A液：重组穿梭质粒 20μl，腺病毒基因组质粒20 μl，10?HBS 5 μl，去离子水5 μl B液：DOTAP 30 μl， 10?HBS 10 μl，去离子水 60 μl 2、将A、B两液混合，室温孵育15分钟 3、A、B混合液与无血清DMEM混合 4、倒去培养瓶中的旧培养液，加入上述混 合液 5、培养48小时后更换新鲜培养液 注意事项 选用传代次数少的293细胞 转染时293细胞不要太密 50－60% 不要更换培养液 用高浓度NaHCO3调节培养液PH值 设阴性对照 共转染后293细胞的病变效应 发生在转染后10－12天 表现：细胞肿胀、变圆，部分的细胞脱壁漂浮－CPE 注意与细胞老化和营养不足鉴别 重组腺病毒的鉴定 病变293细胞于液氮、37°C反复冻融，离心 取上清提取重组病毒DNA 用目的片段引物和病毒基因组特征片段引物作PCR 病毒滴度测定 24孔培养板每孔接种1×105个293细胞 培养24小时后，取病毒转染液0.2ml加PBS至总量2ml，混匀后作10倍比稀释至第8管，每孔加入不同稀释度的病毒液0.2ml。 37°C 5%CO2培养1小时后，每孔补加1.5ml培养液，继续培养36－48小时 病毒滴度测定 观察细胞病变情况，取100%出现CPE的稀释度计算病毒滴度： 105细胞×稀释度×10个病毒/细胞 pfu/ml= 0.2ml 重组病毒的扩增 293细胞大规模培养：悬浮培养，单层培养 用收集的病变细胞培养上清或冻融上清感染293细胞 反复培养、感染 收集大量的病变细胞及病毒上清 病变细胞及病毒上清分别保存于-70°C 重组病毒的纯化 初步纯化 1、液氮、37°C反复冻融收集的病变293细