荧光标记的siRNA(FAM-siRNA)使用说明-上海吉玛制药技术有.pdfVIP

上海吉玛制药技术有限公司 Shanghai GenePharma Co, Ltd 荧光标记的siRNA （FAM-siRNA ）使用说明 一、荧光标记的siRNA 转染效率的高低可以通过荧光标记的siRNA （FAM-siRNA ）实现。 FAM-siRNA 转染细胞后，可以用荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、流式细 胞仪等检测，确定是否有效转染和优化转染条件。FAM-siRNA 还可用作siRNA 胞内定位及双标记实验（配合标记抗体）来追踪转染过程中导入了siRNA 的细 胞，将转染与靶蛋白表达的下调结合起来。 二、使用荧光标记的siRNA （FAM-siRNA ）检测转染效率 1 FAM-siRNA的溶解及保存 1.1 由于OligoRNA很轻的干膜状附在管壁上，打开时极易散失，所以打开离心 管前先离心，然后再慢慢打开管盖，溶解时加适量DEPC水后盖上管盖，振荡溶 解。 1.2 需要浓度20uM的样品，如何计算重悬siRNA缓冲液的量？你购买了1OD的 siRNA ，想溶解为20uM 的样品，应该使用150ul附送的DEPC水去重悬1OD的 siRNA,溶解后为20uM的样品。 1.3 贮存和稳定性：-20℃，避光保存，冻干粉或液体。液体（贮存浓度为20μM ） ．． 避免反复冻融，GenePharma保证在上述条件下siRNA oligo的稳定性可达到6个 月。 2 转染 2.1 使用lipofectamin2000 转染的步骤（以贴壁细胞为例，仅供参考） (1) 以24孔培养板操作为例（其他孔板各种的试剂用量，请参照 5 “Lipofectamine2000 manual” ），转染前一天，将0.5~2X10 个细胞接种于培养板 中，每孔中加入约500ul无抗生素的培养基，使转染时的细胞密度能够达到30 ～ 50 ％； 如有疑问欢迎垂询 电话：021 E-mail:support@ (2) 取1μl/孔 Lipofectamine2000 （使用前轻轻摇匀），用50μl Opti-MEM I Reduced Serum Medium稀释。轻轻混和后在室温孵育5 min； (3) 取2ul FAM-siRNA，用50μl Opti-MEM I Reduced Serum Medium 稀释，轻轻 混和均匀; (4) 稀释的Lipofectamine2000 （2 ）经过5min 的孵育后，与稀释FAM-siRNA （3 ） 轻轻混和，室温静置20min ，以形成FAM-siRNA-转染试剂混和物，如果溶液出 现浑浊，属于正常现象，不会影响转染效果。 注意：稀释的Lipofectamine2000 （2 ）尽量在25min 之内，和稀释的FAM-siRNA 混和，如果放置时间过长，可能导致转染试剂活性的降低; (5) 将FAM-siRNA-转染试剂混和液（4 ）加入含有细胞及培养液（约含400ul ）的 孔中，轻轻摇晃孔板，使混和； (6) 在37 ℃的CO2 培养箱中培养，4-6 小时后可将培养基换为含血清的完全培 养基(该步骤可以省略); (7)转染6小时后即可检测转染效率：流式细胞仪、荧光显微镜、激光共聚焦显微 镜等（见后面）。 2.2 转染操作注意事项： （1 ）FAM-siRNA 的转染过程和普通siRNA 是一样的，注意整个实验过程要尽 ． 量避光，建议转染时室内和超净台内不要开灯； ．．． ．．．．．．．．．．．．．．．． （2 ）保持FAM-siRNA 管外有锡纸包裹，在静置lipo-siRNA 过程中尽量避光， ．．．． （3 ）转染操作尽量快，操作时间尽量短，操作完毕请