机械应力刺激对成牙骨质细胞骨桥蛋白表达影响的研究.pdfVIP

广东牙病防治 2011年 12月 第 19卷 第 12期 材料和方法 收集样本，用 Trizol提 取样本 总 RNA，采用 1．主要材料和设备 TakaraRT—PCR试剂盒进行逆转录。逆转录反应体 成牙骨质细胞株 OCCM．30(美 国华盛顿大学赠 系如下：三磷酸碱基脱氧核苷酸混合液 1txL，不含 送)，75mm 蓝盖斜颈细胞培养瓶 (BDFalcon，美 Mg 缓冲液 1 L，逆转录酶0．5IxL，RNA酶抑制剂 国)，Trizol试剂 (Invitrogen，美 国)，RT—PCR试剂盒 0．25txL，随机引物0．5IxL，MgC122txL，RNA2txL， (Takara，日本)，DMEM／F12粉剂 (Gibco，美 国)，四 双蒸水 2．75txL。将上述 10 L反应溶液30℃保温 点弯曲细胞力学加载仪 (专利号 ZX，中 10rain，42℃保温30rain，99℃保温5分rain，5℃ 国)，具体见参考文献 ¨J。 保温 5rain，逆转录得到模板 cDNA。 2．方法 将 cDNA样本在 FTC2000实时荧光定量基因扩 (1)分组 本实验设 1个对照组 (不加力)和 增仪上进行 目的基因 OPN及 内对照 GAPDH基因 3个实验组 (2000txstrain张应力组 、2000ixstrain PCR扩增。反应体系如下：三磷酸碱基脱氧核苷酸 压应力组 、4000~strain压应力组)。 混合液0．36IxL，MgC123 L，缓冲液 3 L，Taq酶 (2)细胞培养和加力 2组同时种板，按照密度 0．3 L，Taqman探针0．6txL，正向引物 1txL，反向引 2×10 个 ／mL将 OCCM．30接种于加力板上，每板 物 1txL，cDNA模板5 L，双蒸水 15．74 L。扩增条 2mL，细胞贴壁 6h后加入含 10％新生小牛血清的 件如下：94℃2min，94oC20S，54cCj(GAPDH的 DMEM培养液，于37℃、95％空气、5％CO2条件下 退火温度)20S，60℃ 30S，45个循环。OPⅣ的退 培养48h后，将加力板转移到加力盒内进行加力。 火温度为 58 。 各组分别在 3h、6h、12h、24h4个时间点检测 收集数据，绘制动力学曲线，测定各样本 OPN OPNmRNA的表达。实验重复 3次。 基因的阈值循环数 (thresholdcycle，Ct)值，并与 (3)OPNmRNA的表达 探针法实时荧光定量 GAPDH基因的Ct值进行 比较，得出待测样品的相对 PCR技术检测 OPNmRNA的表达 ，引物和探针根据 拷贝数 。相对拷贝数 =1．9 ，‘ Ct= 目的基 因 NCBI基因库中小 鼠OPN基 因及序列设计 ，内参为 ct一管家基 因 ct， Ct=待测样本 中 目的基 因 三磷 酸甘油醛脱氢酶 (glyceraldehyde一3一phosphate Ct一对照样本中 目的基因 Ct。 dehydrogenase，GAPDH)管家基 因 (表 1)，由上海生 3．统计学分析 工生物工程技术服务有限公司合成。 采用 SPSS11．5软件对所得数据进行单 因素方 差分析，若结果有统计学意义，再用 LSD法对实验组 表 1 DPⅣ和GAPDH基因的引物和探针序列 和对照组进行组间均值配对 比较 ，取 P0．05为差 基因 引物和探针 序列 片段大小(bp)