小鼠Pim-3基因siRNA慢病毒载体的构建及表达.pdfVIP

·186 · 湖北医药学院学报( J HBUM) 20 12年6月，3 1( 3) 引用本文格式：陈继舜，钱航，杨汉东，等．小鼠Pi m- 3基因si RNA慢病毒载体的构建及表达[ J ] ．湖北医药学院学报，2012 ，31( 3) ：186一 。 190 ． ·’一—+一 ‘’一一—一一—+- 一+一—— 卜一 ·- 卜一—_一— 卜一—●一 ·- 卜- — 卜- — 卜- +一+—+一 ·— 卜一+一，- 卜- - 4一- - +- - - +- - —- 卜- 小 鼠Pi m一3基 因s i RNA慢病毒载体 的构建及表达 陈继舜1， 钱航1， 杨汉东1， 闵新文1， 郎明健1， 张鹏1’2 ( 湖北医药学院1心脏病中心；2生理学教研室，湖北十堰442000) [ 摘要] 目的：本研究拟构建针对Pi m．3基因的si RNA慢病毒载体，诱导靶细胞中Pi m- 3基因沉默。方法：分析 Pi m·3 mRNA序列特征，根据s i RNA设计原则，设计并合成特异性针对小鼠Pi m- 3的s i RNA靶DNA序列及阴性对 照序列。用限制性核酸内切酶将pGC I L- GFP载体线性化，将寡DNA片段退火成含有粘性末端的DNA双链后，与 慢病毒骨架质粒连接转化至大肠杆菌中进行重组，运用PCR技术筛选阳性克隆并测序，得到p C- Pi m一3 shRNA质 粒。采用脂质体将p C．Pi m．3 shRNA质粒和辅助包装质粒共转染到HEK293细胞中包装形成慢病毒。采用倍比稀 释法测定慢病毒滴度。慢病毒感染NI H3T3细胞，运用实时定量PCR技术检测Pi m．3基因mRNA表达水平，运用蛋 白免疫印迹技术检测Pi m- 3蛋白表达水平。结果：酶切后获得7 ．5 kb 的pGC I L．GFP片段。DNA片段成功连接到 pGC I L- GFP载体；重组慢病毒的滴度约为2 X 109 TU／mL。慢病毒能够高效感染靶细胞，并显著抑制内源性Pi m- 3 基因的mRNA( 抑制率超过70 ％) 和蛋白( 抑制率超过80 ％) 表达。结论：针对Pi m- 3基因靶序列CCTCTr CGACT- TCATCACT的shRNA重组慢病毒能够有效沉默靶细胞Pi m- 3基因。 [ 关键词] Pi m- 3 ；RNA干扰；慢病毒载体 [ 中图法分类号] Q782 [ 文献标识码 】 A [ 文章编号] 1006—9674( 20 12) 03—0186—06 Cons t r uct i on of Lent i vi r us Expr es s i ng s i RNA Tar get ed Mouse Pi m- 3 Gene CHEN J i - shunl ，QI AN Han91，YANG Han ·don91，MI N Xi n- wenl ，LANG Mi ng-j i anl ，ZHANG Pen91，2( 1Car di ova scul ar Res ear ch Cent er ；2Depar t ment of 秭芦i Df _ ogy ，Hubei Uni ver si t y of Medi ci ne ， hi yan ，Hubei 442000 ，Chi na) Abst r act ：Obj ect i ve To const r uct