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鱼类胚胎冷冻的研究进展 周波 1 胡洋 2 (1. 动科 1061, 2. 07 级研究生) 摘 要：随着胚胎移植的商业化，胚胎冷冻已被广泛应用，同时胚胎冷冻在家畜育种、濒危 动物等遗传资源的保护、动物克隆方面的地位日益重要。随着胚胎冷冻技术的逐步成熟，许 多学者对鱼类的胚胎冷冻保存进行了大量研究，并且在抗冻剂、冷冻降温方法和解冻复活技 术等方面取得很大进展。本文拟对鱼类胚胎低温冷冻保存的原理、冷冻保护剂的选择、冷冻 方法以及影响鱼类胚胎冷冻的主要因子等方面作一综述。 关键词：鱼类；胚胎冷冻 自1949 年英国生物学家 Polge 和 Smiht[1]发现存在于甘油溶液中的动物精子能够在低温 下长期存活这一现象以后，人类开始了对生物在低温环境下的生物学的研究。低温生物学在 医疗、生物种类保存及品种繁殖等方面取得了巨大的成就。在哺乳动物精子和胚胎的低温保 存研究方面，自从 1972 年 Whittingham[2]发明慢速冷冻法成功地冻存了小鼠胚胎，随后胚胎 冷冻技术不断的得到了发展，目前利用胚胎冷冻技术已经能够长期保存小鼠、牛、绵羊、山 羊、兔、大鼠、猪、人等的胚胎[2-6] 畜牧业方面哺乳动物胚胎的低温保存，为家畜优良品种种质的保存和运输提供了极大的 方便，也使濒危物种遗传物质得以保存。这一技术在哺乳动物中得到广泛运用的同时，研究 者也将胚胎冷冻技术应用到了鱼类的胚胎保存中。自从 20 世纪 50 年代初英国学者 Blxaetr(1953)[7]首次成功冷冻保存大西洋鲜精巢以来，世界各国许多学者对鱼类配子和胚胎 的冷冻保存进行了大量研究，在抗冻剂的保护机理、稀释液配制、抗冻剂种类和浓度、冷冻 降温方法和解冻复活技术等方面进行了一系列的研究，并取得很大进展。鉴于鱼类胚胎冷冻 保存在鱼类种质保存、遗传多样性保护及鱼类育种研究等领域所具有的重要意义和应用价 值，近 20 年来,鱼类胚胎低温和超低温保存的研究引起人们的广泛关注和高度重视。本文主 要就胚胎冷冻保存中的相关问题作一简要概述。 1 低温生物学原理 低温生物学(cryobiology)是探索低温条件下生命现象的特征和规律，以及生物体保存的 一门科学。[8]它包括的内容十分广泛，几乎所有在低于正常(生物适于生存的)温度下进行的 与生物有关的实验研究或理论探索都属于低温生物学的范畴。 低温保存就是通过低温抑制细胞代谢，使细胞由常温下的高能耗、强代谢状态，进入一 种能量消耗、新陈代谢降至最低点的休眠状态。其中细胞自身发生可逆性变化，蛋白质、酶 以及其它细胞结构均未被破坏，复温后就能恢复活力。一般认为在 0 一 60℃的温度区间细 胞内水分子会重新移动按一定次序排列成冰晶，造成损伤细胞的不可逆变化，故该区间应以 适宜速率尽快越过;而低于一 60℃后，细胞内的水分无序排列不再移动，进入坚硬、均质、 团块状的玻璃化状态，该可逆状态对细胞结构不会造成损伤(李纯等，2000)[9] 。 在大多数情况下,细胞的过冷程度比周围溶液更深，细胞外溶液先结冰,使溶质浓缩，导 致细胞外环境渗透压升高。如果降温足够慢的话，可以通过脱水来维持细胞内外环境渗透压 平衡。但是如果降温过慢，细胞长时间处于高渗环境中，对细胞产生渗透休克；如果降温过 快，细胞内水分又来不及移到细胞外，而在细胞内形成冰晶，冰晶会破坏细胞器，刺破细胞 膜,导致细胞死亡。通过冻前在稀释液中加入一定浓度的低温保护剂，让细胞在保护剂中平 衡并适当脱水，可将损伤降到最低限度。胚胎细胞内水分含量达 80% 以上，在冷冻过程中 有 90% 的水分形成游离水，而游离水在低温下易形成冰晶。一般胚胎在冷冻过程中不可避 免要形成细胞内冰晶，但只要不形成大冰晶，而是维持微晶状态，细胞将不受伤害。 胚胎在冷冻过程和解冻过程中两次通过易形成冰晶的危险温区(-15℃~-50 ℃) ，采取适当 的冷冻方法和低温保护剂，使胚胎安全通过危险温区,胚胎在冷冻前进行处理，向保存液中 加入保护剂如甘油或蔗糖等，改变细胞膜渗透性和溶液渗透压，防止溶液效应和渗透压差异， 减少降温和复温过程冰晶的形成。常规的冷冻保存胚胎一般在胚胎脱水以前诱导结晶，然后 缓慢降温脱水，解冻时快速复温到常温。现今通用的玻璃化冷冻法,高浓度的渗透性保护剂 组成的玻璃化液是一种粘稠的玻璃态物质，低温时它不结晶就可固化。胚胎在这种溶液中脱