E2F3基因原核表达载体的构建.pdfVIP

第26卷 第5期 黑龙 江 大 学 自然科 学 学报 Vol_26 No．5 2009年 10月 JOURNALOFNATURALSCIENCEOFHEILONGJIANGUNIVERSITY October，2009 E2F3基因原核表达载体的构建 任 轶 ， 林 谅 ， 丁 虹 ， 蒙世杰 (1．陕西省动物研究所 实验中心，西安 710032；2．西安皓天生物技术有限公司研发部，西安 710075；3．武汉外国 语学校 江南分校，武汉 430079；4．西北大学 生命科学学院，西安 710069) 摘 要：为研究E2F3转录因子的结构、功能及其与肿瘤发生的联系，从人组织中克隆E2F3基 因，通过巢氏PCR和桥联PCR成功构建了E2F3的原核表达载体，实现了对E2F3基因的原核表 达 ，并用Western检测了重组蛋 白。研究中发现 E2F3cDNA编码序列中含有一段富含 GC的区域， 该 区域对 E2F3基因的PCR扩增影响很大。 关键词 ：E2F3；PCR；原核表达 中图分类号：Q782 文献标志码 ：A 文章编号 ：1001—7011(2009)05—0662—04 O 前 言 E2F家族是众多转录因子中重要的一个家族 ，该家族包括 7个成员 E2F1，E2F2，E2F3，E2F4，E2F5， E2F6，E2F7。E2F蛋白通过与DP基因家族编码的蛋白形成异源二聚体来调节靶基因的转录。 目前已经发 现E2F因子在细胞周期调控、细胞的增殖，肿瘤的发生和抑制以及细胞凋亡方面都起着重要的作用¨ 。 国外对 E2F3因子研究较早，Lees等 1993年用低严谨性的杂交，用 E2F1探针从NALM一6eDNA文库 中分离 出了E2F2和 E2F3J。He等2000年发现了E2F3b蛋白，它相对于E2F3因子而言缺少 了N端 101个氨基 酸，而且表达丰度与E2F3也不一样 j。随后Wu等又发现E2F3在小鼠的胚胎发育过程中起着至关重要的 作用 ]。2004年Feber等发现E2F3蛋 白在膀胱癌组织中有着异常高的表达，而且表达量随着癌龄的提高 而提高，他们将 E2F3基因列为膀胱癌的一个候选基因l_I。目前，国内对 E2F因子研究较少，且主要集中在 E2F1上，夏可以等2004年研究认为E2F3的失活表达是 胃癌发生的关键 。本研究旨在构建E2F3原核表 达载体，以获得这一重要的蛋白用于研究其功能和结构。 1 材料和方法 1．1 菌种和质粒 各种工程菌和质粒均由上海博亚公司惠赠，人肝癌细胞株 由华中科技大学同济医学院免疫系廖雯君硕 士惠赠。 1．2 总 RNA抽提 参照Trizol使用说明(北京鼎国生物技术有限责任公司)。 1．3 逆转录 (ReverseTranslation)制备cDNA模板 ① 用PolyT引物为逆转录的引物制备eDNA，具体方法参见 《分子克隆》。 ② 用随机引物 15N为逆转录的引物制备eDNA，具体方法参见 《分子克隆》。 1．4 巢氏PCR E2F3特异性引物为 ： PrimerF (bp1)：5 一AGCGGATCCATGAGAAAGGGAATCCAGCC一3 收稿Et期：2009—01—20 基金项目：长江学者和创新团队发展计划基金资助项 目(PCS1RT) 作者简介：任 轶 (1982一)，女，硕士，研习员，主要研究方向：分子生态学 第5期 任 轶等：E2F3基因原核表达载体的构建 ·663· PrimerA (bpl395C)：5 一GCGAAGCTFACTACACATGAAGTCTTCCACCAG一3 巢式 引物为 ： Primer(out)F：5 一AAAGAGCAGGAGCGAGAGAT一3， Primer(out)R：5 一TCTTGGAGGAAGAAGGTA(G一3 先用巢式引物进行第一轮 PCR预扩增 ，PCR程序是 95cC10min；95oC1rain，55℃ 1rain，72℃2min， 30cycle；72oC10min。然后取第一轮 PCR产物 1txL作为模板用 E2F3引物进行第二轮 PCR扩增。总体积 为50IxL，PCR程序是 ：95o