膜片钳（patchclamp）技术及其在医学研究中的应用.pptVIP

膜片钳(patch clamp)技术及其在医学研究中的应用 蔡浩然 内 容 （一）生物电信号及电生理学的发展； (二)　膜片钳技术原理及几种钳位 方式 (modes or configuration）； （三）脑片膜片钳技术； (四）在医学研究中应用举例。 （一）生物电信号及电生理学的发展 Galvani (1737-1798)发现生物电 1.临床上无创体表电信号记录 1）自发电（EEG、ECG等） 2）诱发电（AEP、ERG、VEP 和 SEP等） 特点 ①细胞群总体综合电位； ②是调幅信号； ③无创伤可从体表记录； ④信号较强（微伏以致毫伏级），S/N 大。 2. 神经元及受体 神经元(neurons): 胞体(细胞).树突.轴突.突触。 受体(receptors): （1） 作用剂：激动剂；拮抗剂。 （2）分类： 1. 按激动剂分：谷氨酸型; γ氨基丁酸型; 乙酰胆碱型等等； 2. 按反应分: ionotropic; metabotropic. 离子通道(channels): 1. 离子: (Na+, K+, Ca2+,Cl-.) 2..基因: (TASK, HCN.等等) 类脂双分子膜及通道蛋白 3.胞外和胞内记录 特点： 1）单细胞放电； 2）一般是调频信号：All or None , 0 or 1 系统； 3）需暴露器官和组织； 4）幅度为mV级，duration (?S→mS)。 胞外记录：脉冲甄别器。 胞内记录：要求轴突或胞体较大，膜的半透性、膜电位、静息电位、去极化、超极化、超射、复极化、动作电位（action potential , spike, fire） 电信号及电流强度 (二)膜片钳技术原理及几种钳位方式（modes or configuration） 1.膜片钳技术原理 （1）钳位电压的作用，“钳”的意义（clamp）。 （2）小膜片(patch)，电源的电阻越大，噪音电流越小。 1. 电压钳（CV）：记录信号电流（pA）,可作I-V曲线， 最常用，小细胞可作全细胞记录； 信号源的热噪声公式：σn= (4KT?f/R)1/2 2.电流钳（CC）：记录信号电压，一般钳在“0”pA 下。 2.几种钳位方式 常用的四种膜片钳方式： 1）细胞贴附式(cell attached)； 2）外面向外膜片钳(outside out patch)； 3）内面向外膜片钳(inside-out patch)； 4) 全细胞记录(whole cell recording)。 四种膜片钳方式的形成 实验标本不同可分为： (1) 分离细胞膜片钳：研究离子通道、克隆基因, 较容易，但在人为环境下。 1．培养的单细胞； 2．从组织（心肌等）分离出单细胞； (2) 脑片膜片钳：Blanton（1989） (3) 在位膜片钳。 （三）脑片膜片钳技术 1.优点： (1) 更接近在原位环境； (2) 可研究突触（synapse） 的受体和机能；  2.脑片制作（以Xenopus为例） 1、动物断头，在4~5℃的冰——任氏液中取脑； 2、溶液充氧（95%）与CO2（5%）混合气； 3、刀片，丙酮浸泡； 4、低熔点琼脂溶液包埋，-18℃约5分钟； 5、振动切片机，切成300 ? (200-500?)的脑片； 6、低温（5℃）蔗糖溶液，孵育30-45分钟； 7 、室温任氏溶液孵育30分钟以上后开始记录； 3.电流（压）记录： 1.记录小室（Chamber）用充氧任氏溶液灌流（流速1.5-2.0 ml/min） 2.将脑片转入小室并用小银丝压住 4.全细胞记录与传统的细胞内记录的差别： 1、对细胞损伤较小； 2、电极内液与胞内溶液可以很好交换； 3、不需要大细胞，10? 的神经元即可； 4、可以改变和控制膜电位（HP）。 5.全细胞记录的几点要求： 1、溶液必须非常洁净和新鲜，电极内液须用0.2?的过滤器过滤； 2、电极要临时拉制（2小时内）； 3 、在电极进入溶液前加正压。 6.几种脑片膜片钳方法: [用顺置（up-right）40倍显微镜] 1、清洁（cleaning）脑片法（图） 2、盲（blind）法 3、NIR-DIC成像，水镜头