SRY基因的检测.ppt

SRY基因的检测 原理 1聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）的基本原理是，通过热变性使目的DNA（模板DNA）双链解开；通过退火将引物复性结合到它们的互补位置；通过DNA聚合酶延长引物，反复循环体外扩增出大量一对引物之间的DNA片段。 聚 合 酶 链 反 应Polymerase Chain Reaction（PCR） PCR基本工作原理 以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板3’和5’端相互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制延模板链延伸直至完成新的DNA合成。 重复这一过程，可使目的DNA片段得以扩增。 PCR体系基本组成成分 第一轮循环 第二轮循环 第三次循环 PCR的主要用途 原理 2 人类个体的表型性别是由Y染色体决定的,具体地说是由Y染色体上编码睾丸发育的睾丸决定因子(testis determining factor,TDF)基因所决定，TDF基因的存在决定着睾丸的发育，即决定个体发育为男性。研究表明TDF基因位于Y染色体短臂与拟常染色体相接的35kb区域，该区域又称为Y染色体性别决定区（sex determining region of the Y，SRY）。 。 3 在SRY基因区域设计特异的引物，如果能够利用PCR技术体外扩增出SRY基因片段，即可判断为男性，否则为女性。本实验在SRY基因区域内设计了一对引物，利用引物Y1.5/ Y1.6扩增出一239bp的片段。 4 利用PCR技术扩增SRY基因片段检测性别具有广泛的实际应用价值，如结合细胞遗传学的核型分析，通过确认SRY所在区域的缺失或易位，诊断46，XY女性或46，XX男性性反转综合征的患者；通过检测胎儿的性别，预防甲型血友病、G6PD缺乏症等X连锁隐性遗传病患儿的出生； 一、?由微量外周血标本制备模板DNA 试剂与材料： 1、 细胞裂解缓冲液 （SDS ；蛋白酶K ） 　　2、酚：氯仿：异戊醇（25：24：1体积比） 　 3、3mol醋酸钠（PH5.2） 　 4、无水乙醇，-20℃保存 　 5、70%乙醇，-20℃保存 6、TE缓冲液 步骤 1、1.5ml Eppendorf离心管中加入细胞裂解液100μl。 2、取末梢血一滴（约5-10μl）立即悬浮细胞裂解液中，37℃保温2小时。 3、加入100μl酚：氯仿：异戊醇（25：24：1体积比）混合液，盖紧。轻轻摇混，充分混合；室温15000rpm离心5分钟。 4、用开口粗的吸管转移上层水相于新的Eppendorf离心管，按步骤5重复抽提1次。如果水相还混浊，增加一次酚抽提。 步骤 5、转移上层水相，加入10μl 3mol醋酸钠（PH5.2）轻摇混匀，再加入250μl冷无水乙醇沉淀DNA。室温放置10分钟。 6、4℃15000rpm离心15分钟，使DNA沉淀（颗粒化）。 7、弃上清，加70%冷乙醇500μl轻振混匀，4℃15000rpm离心5分钟。 8、弃上清，将Ep管倒置在纸巾上，完全除去水分。将DNA自然干燥。 9、加10μl TE溶解，制成DNA样品。（进行PCR时，取1μl即可）。 二、PCR检测性别 试剂与材料： 1、?? 上、下游引物 （各5 μmol/L） 2、?? 模板DNA溶液 3、?? 10×PCR缓冲液：（高压灭菌） 4、?? dNTPs溶液（2.5mmol/L原液） 5、?? Taq DNA聚合酶（5U/μl） 6、?? 液体石蜡（高压灭菌） 琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段 7、电泳级琼脂糖 8、电泳缓冲液：5×TBE贮存液 9、5mg/ml的溴化乙锭溶液，4℃暗存。 10、上样缓冲液：0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青，30%甘油于水中。4℃贮存。 11、微波炉、电泳仪、水平电泳槽、制胶模和加样孔梳齿。 12、透射紫外灯、照相机和胶带纸。 （二）、PCR反应 1、?? 在0.5ml Eppendorf管中依次加入 H2O 60.5μl 10×PCR缓冲液 10μl dNTPs溶液（2.5mmol/L原液） 8μl（0.2mmol/L） 上游引物 （5 μmol/L） 10μl （0.5μmol/L） 下游引物 （5 μmol/L） 10μl（0.5μmol/L） 模板DNA溶液（基因组DNA溶液） 1μl Taq DNA聚合酶（5U