抗鼠CTLA-4单链抗体的构建与表达及其免疫学活性的鉴定.pdfVIP

维普资讯 第 37卷第 3期第 290页 华 中科技大学学报 (医学版) V0I_37 No．3 P．290 2008年 6月 ActaMedUnivSciTechnolHuazhong June 2008 抗 鼠CTLA一4单链抗体的构建与表达 及其免疫学活性的鉴定* 彭国平 周 承 吴 炜 孙 雯。 田 锋。 贺纪凯。 陈 智 浙江大学医学院附属第一医院传染病研究所 ，传染病诊治 国家重点实验室，杭州 310031 。浙江大学医学 院附属 口腔 医院，杭州 310003 。浙江大学医学院临床 医学系，杭州 310023 摘要 目的 构建具有免疫学活性 的抗小 鼠细胞毒性 T淋 巴细胞相关抗原 4(CTLA-4)单链抗体 ScFv (single chainfragmentofvarietyregion)，为进一步将其应用到动物体 内奠定基础 。方法 采用 RT-PCR技术 ，从分泌抗小 鼠 CTLA-4单克隆抗体(mAb)的杂交瘤细胞中扩增mAb的 VH、VL基因，并进一步将其组装成 VH—Linker-VL型的 ScFv片段。将 ScFv片段亚克隆至 pGMET载体，测序正确后将其克隆至真核分泌型表达载体 pSect2一GFP，将pSect2一 GFP-ScFv纯化质粒转染 中国仓 鼠卵巢细胞(CHO)并进行表达 ，同时经 Zeocin筛选稳定表达株 。用 Westernblot方法 检测 ScFv融合蛋 白的表达 ，采用 ELISA检测 ScFv的亲和活性 。结果 经 Zeocin筛选 2周后 ，CHO细胞株可稳定表达 GFP—ScFv蛋白。Westernblot法证实GFP—ScFv蛋白在细胞上清和细胞裂解液中均有表达，大小约 55kD。ELISA检 测表明，CHO培养上清 中的GFP-ScFv蛋 白经浓缩初纯后能与重组小 鼠CTLA-4纯化抗原结合 ，并具有抑制亲本单抗 与其结合的能力。结论 成功构建了抗小鼠CTLA-4的ScFv真核表达载体，并能有效表达出具有免疫学活性的ScFv 融合蛋 白。 关键词 细胞毒性 T淋巴细胞相关抗原 4； 单链抗体 ； 真核表达 ； 免疫学活性 中图法分类号 R392．1 Construction．Expression andImmunologicActivityofM urineAnti·CTLA ·4ScFv PengGuoping。ZhouCheng。W uW eietal InstituteofIn{ectiousDiseases，NationalKeyLaboratoryofInfectiousDiseases，TheFirstAffiliated Hospital，CollegeofMedicine，ZhejiangUniversity，Hangzhou310003 Abstract 0bjective Toconstructandexpressthesinglechainfragmentofvarietyregion(ScFv)ofmonoclona1antibody againstmurineCTLA-4andanalyzetheimmunologicactivityofrecombinantScFvprotein．M ethods TheVL andVH genes wereclonedbvR-r_PCR from anti—murineCTLA-4 mAbexcreted by hybridomacells．VH—linker-VL fragment(ScFv)was constructedandsubclonedintovectorpGMET andthenclonedintovectorpSect2一GFP．ThepurifiedpSe