不同有机溶剂中生防菌JK-2活性物质的GCMSD分析.docVIP

不同有机溶剂中生防菌JK-2活性物质的GC/MSD分析( 车建美1,2，陈铮2，刘波2*，关雄1* （1．福建农林大学生物农药与化学生物学教育部重点实验室 福州 350002；2. 福建省农业科学院农业生物资源研究所，福州，350003） 摘要： 关键词： 1 材料与方法 1.1 试验材料 试验材料：生防菌JK-2（短短芽孢杆菌JK-2，Brevibacillus brevis JK-2），系本实验室从发生枯萎病的田块分离得到的一株拮抗菌株。试验试剂：分析纯三氯甲烷、丙酮、无水乙醇和甲醇。试验仪器：美国Agilent公司制造的7890A/5975C气质联用仪（GC/MSD）。操作软件：Agilent G1701EA GC/MSD ChemStation。 1.2 试验方法 1.2.1 生防菌JK-2活性粗提物的提取 将新鲜培养的JK-2发酵液常温6000 rpm离心30 min，取上清液，加入60 g/L的大孔树脂AmberliteXAD16混合，28 ℃，160 rpm振荡4 h后，填柱，并用水洗柱后，丙酮洗脱，收集丙酮洗脱液，40 ℃旋转蒸发进行浓缩，得到JK-2活性粗提物。称取50 mg粗提物干粉于玻璃试管中（12×75 mm），分别加入1 mL三氯甲烷、丙酮、无水乙醇、甲醇和二甲基亚砜5种有机溶剂中，常温静置2 h后，取提取液进行活性检测。 1.2.2 不同有机溶剂中生防菌JK-2活性物质的抑菌活性检测 采用双层培养基进行抑菌活性检测（葛慈斌，2009）。在直径90 mm的无菌培养皿中加入20 mL融化的1.8%NA培养基，待其冷却后，加入上层培养基；上层培养基的制备方法为将指示菌大肠杆菌K88的发酵液按照0.5%的比例加入50 ℃左右的NA培养基中，按照25 mL/皿倒入平板中，待冷凝后使用。采用直径7 mm的无菌打孔器在培养基上打孔，取100 μL不同有机溶剂的提取液加入加样孔中，采用等量的以上纯有机溶剂作为阴性对照。将平板置于28 ℃条件下培养16-18 h后进行抑菌活性检测，试验重复3次。 1.2.3 不同有机溶剂中生防菌JK-2活性物质的GC-MS分析条件 色谱条件：采用HP5-MS色谱柱，进样口温度250℃，压力5.5977 psi，总流量104 mL/min，隔垫吹扫流量3 mL/min，分流比100:1。升温程序为：50℃保持2min，以3℃/min上升到120℃保持5min，以10℃/min上升到200℃，然后以20℃/min上升到280℃保持5min。质谱条件：溶剂延迟：4.00min；采集模式：全扫描；EMV模式：相对值；全扫描参数：开始时候的质量数50.00amu，结束时的质量数550.00mu；MS温度：离子源230℃，MS四级杆150℃。 2 结果与分析 2.1 不同有机溶剂中生防菌JK-2活性物质的抑菌活性检测 不同有机溶剂中生防菌JK-2活性物质提取物的抑菌活性有所不同。甲醇中生防菌JK-2活性物质提取物的抑菌活性最高，抑菌圈直径达到18.42 mm，三氯甲烷中的提取物抑菌活性最低，抑菌圈直径为7.91 mm。在p≤0.05时，丙酮、无水乙醇、甲醇中生防菌JK-2活性物质提取物的抑菌圈直径差异不显著，但是与三氯甲烷提取物中的生防菌JK-2活性物质的抑菌圈直径差异显著。说明生防菌JK-2活性物质在不同有机溶剂中提取物的溶解性有所不同。 图1 不同有机溶剂中生防菌JK-2活性物质的抑菌活性 图2 不同有机溶剂中生防菌JK-2活性物质的抑菌圈 2.2 不同有机溶剂中生防菌JK-2活性物质的总离子流图谱分析 不同有机溶剂中生防菌JK-2活性物质的总离子流图谱分析表明，在三氯甲烷和丙酮提取物的总离子流图谱中峰面积较大的3个峰分别为羟苯乙酯、邻苯二甲酸二丁酯和邻苯二甲酸单（2-乙基己基）酯；在无水乙醇和甲醇提取物的总离子流图谱中峰面积较大的3个峰分别为羟苯乙酯、Ergotaman-3,6,18-trione, 9,10-dihydro-12-hydroxy-2-methyl-5-(phenylmethyl)-,(5à,10à)-和邻苯二甲酸单（2-乙基己基）酯。羟苯乙酯和邻苯二甲酸单（2-乙基己基）酯是4种有机溶剂提取物中均还有的成分。 在4种有机溶剂提取物的GC指纹图谱中：（1）在保留时间为22.000-25.000区域中，三氯甲烷提取物、丙酮提取物和无水乙醇提取物共有2个物质的色谱峰，而甲醇提取物有3个物质的色谱峰；（2）在保留时间为25.001-30.000区域中，三氯甲烷提取物中有12个物质的色谱峰，丙酮提取物中有7个物质的色谱峰，无水乙醇提取物中有9个物质的色谱峰，甲醇提取物中共有16个物质的色谱峰；（3）在保留时间为3