PCR方法基因序列全长获取策略.pdfVIP

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１２，３２（１１）：１１５１２３ 基于ＰＣＲ方法的基因序列全长获取策略 １，２ ２ ２ ２ ３ ２ １ ２ 李昆鹏 　朱化彬 　郝海生 　赵学明 　冯　荣 　秦　彤 　张林波 　王　栋 （１吉林农业大学动物科技学院　长春　１３０１１８） （２中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 农业部畜禽遗传资源与利用重点开放实验室　北京　１００１９３） （３乌兰察布职业学院　集宁　０１２０００） 摘要　基因全长序列是研究新基因功能的前提基础，基于ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ）建立了 反向ＰＣＲ、外源接头介导ＰＣＲ和随机引物ＰＣＲ三类基因序列全长扩增方法。虽然早期建立的反 向ＰＣＲ连接效率较低，易产生较高的非特异性扩增，但简单快捷的特点使其在鉴定ＴＤＮＡ插入 位点、基因融合位点等方面应用较多；外源接头介导ＰＣＲ则因特异性的提高而备受欢迎，并衍生 出单特异引物ＰＣＲ、捕获ＰＣＲ和步降ＰＣＲ等多种技术，取得了较理想的扩增效果；而在大量样品 分析中，自动化程度较高的随机引物ＰＣＲ则更具优势。随着功能强大的聚合酶、连接酶、反转录 酶的发现，推动了各种基于ＰＣＲ的基因序列全长获取策略的发展，很多策略也因此而得以改进和 整合，并获取更理想的实验结果，为研究基因结构、功能及其表达产物特性的研究提供了更完整 的信息。 关键词　全长序列　染色体步移　ＲＡＣＥ技术 中图分类号　Ｑ７８１ 　　高通量 ＤＮＡ测序技术的建立与发展为基因组数 导ＰＣＲ和随机引物ＰＣＲ三类。各类技术各有优缺点， 据库的建立与研究奠定了基础，但是作为一种补充，通 且应用的主要领域和潜力各有差别。 过酵母双杂交 （ｙｅａｓｔｔｗｏｈｙｂｒｉｄ）、抑制性消减杂交 １　反向ＰＣＲ （ＳＳＨ）、基因芯片（ｇｅｎｅｃｈｉｐ）技术、噬菌体表面展示 （ｐｈａｇｅｄｉｓｐｌａｙ）等分子生物学和生物信息学技术进行 　　利用限制性内切核酸酶酶切包含已知序列的 特定性状目标基因的鉴定和分析，同样具有重要意 ＤＮＡ，在 ＤＮＡ连接酶作用下，使酶切片段分子内黏性 ［１］ 义 。利用这些技术筛选得到的部分基因序列获得目 末端连接成环，根据已知序列设计引物，对环状 ＤＮＡ 标基因的全长序列，为目标基因生物学功能的进一步 进行ＰＣＲ扩增即可获取两侧未知序列，这种ＰＣＲ技术 研究和应用奠定了前期基础。对于基因组测序已经完 被称为反向ＰＣＲ（ｉｎｖｅｒｓｅＰＣＲ，ＩＰＣＲ）。１９８８年，Ｔｒｉｇｌｉａ 成的少数物种来说，可以轻松地从数据库中找到已知 ［３］ 等 首次利用ＩＰＣＲ扩增靶ＤＮＡ区段两侧未知序列。 序列的侧翼序列，但是这只是研究少数模式生物的情 如图１所示，ＩＰＣＲ首先选取在已知序列中没有酶切位 况。而对于自然界中种类繁多的其他生物而言，基于 点的限制性内切核酸酶消化ＤＮＡ并产生黏性末端，在 ＰＣＲ技术建立的多种染色体步移方法和ｃＤＮＡ末端快 ＤＮＡ连接酶的作用下将 ＤＮＡ酶切片段两末端连接环 速扩增（ｒａｐｉｄａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｃＤＮＡｅｎｄｓ，ＲＡＣＥ）技术 化，再利用针对已知序列的限制性内切核酸酶酶切环 实现了通过已知片段快速获取未知基因序列的研究目 化ＤＮＡ。最后根据已知序列设计一对反向引物，以酶