猪繁殖与呼吸综合征病毒TaqMan荧光定量RT-PCR方法的建立与应用.pdfVIP

第 32卷 第 11期 中 国 预 防 兽 医 学 报 Vo1．32．NO．11 2010 年 11月 ChineseJournalofPreventiveVeterinaryM edicine NOV． 2O1O doi：10．3969~．issn．1008—0589．2010．11．07 猪繁殖与呼吸综合征病毒 TaqMan荧光定量 RT—PCR方法的建立与应用 刘长龙，张建武，韦祖樟，袁世 山 (中国农业科学院上海兽医研究所 猪呼吸系统疾病研究室 ，上海 200241) 摘 要 ：为快速检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)，本研究针对 PRRSV的N蛋 白基 因保守序列，设计 特异性 引物和 TaqMan探针 ，以体外转录的RNA作为标准品，设计并优化 了检测 PRRSV 的 TaqMan荧光定量 PCR方法。应用该方法检测其它主要猪病病原 ，结果均呈 阴性 ；针对 PRRSV阳性 RNA 的检 测灵敏度可以达到 l0拷 贝，比常规PCR灵敏 10倍～1】【0倍；结果表明，本实验建立的PRRsvTaqMan荧光定量PCR方法具有 良好 的特异性、敏感性和重复性。应用建立的方法测定攻毒猪血清中病毒的含量，免疫攻毒组和非免疫攻毒组在第 7d血清中病毒的载量差异不显著，而在第 14d差异显著，免疫攻毒组猪血清中病毒载量明显低于未免疫组。 关键词 ：猪繁殖与呼吸综合征病毒 ；荧光定量 PCR；TaqMan探针 ；RNA标准品 中图分类号 ：$852．65 文献标识码 ：A 文章编号：1008—0589(2010)l1—0858—04 L0一)evel。opment一and‘appIl’lcati。onOt，JraqM‘a‘none-steptIIUOrescence quantitativeRT—PCR assayfordetectionofporcinereproductive andrespiratorysyndromevirus L[U Chang—long，ZHANG Jian—wu，WEIZu—zhang，YUAN Shi—shan (DepartmentofSwineInfectiousDiseases，ShanghaiVeterinaryResearchInstitute，ChineseAcademyofAgriculturalSciences， Shanghai200241，China) Abstract：A quantitativeTaqManone-stepRT-·PCR assayfordetectingPorcinereproductiveandrespiratory syndromevirus (PRRSV)wasdevelopedusingtwopairsofprimersbasedonNproteinnucleotidesequenceofPRRSV．Thismethodwashighly specificanddidnotampli non—specificproductsfrom otherswinepathogens．Itcoulddetect10copiesofRNA atleast，andwas 10to 100foldhighersensitivethan conventionalRT—PCR．Themethodwasusedtodeterminethevirusloadinpigseurm and showedthattheimmunizedpigshadsignificantlylowervirusloadthancontrolanimalsonthe14daysafterviruschallenge． Key words：porcinereproductive and respiratory snydromevirus